HPLC 法測定1-氟萘中工藝雜質和遺傳毒性雜質含量

唐蓮，楊仁明

（1.成都地奧制藥集團有限公司，四川 成都 610041；2.四川奧邦古得藥業有限公司，四川 成都 610097）

1-氟萘作為一種重要的醫藥中間體和起始物料，可用于度洛西汀[1]和達泊西汀[2]等化合物的合成。1-氟萘工業化生產時，主要通過1-萘胺經重氮化、取代、熱風分解和純化處理等步驟合成制得。合成過程中可能引入和降解產生1-萘胺、2-氟萘和萘，其中1-萘胺作為遺傳毒性雜質，需要特別關注其含量。目前已有文獻對1-氟萘中的1 種或幾種雜質含量進行檢測，但均采用酸性流動相體系[3-5]，存在雜質峰型不好或方法靈敏度較低的問題，本文新建靈敏度更高的堿性HPLC 方法對上述3 種雜質進行含量測定，以期為1-氟萘中雜質控制提供參考。

1 儀器

LC-2030C 型高效液相色譜（島津公司）配備四元梯度泵，在線真空脫氣機，DAD 檢測器，Phenomenex Gemini C18 柱（250×4.6 mM，5 μm，Phenomenex 公司）；KQ-800KDE 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW120D 十萬分之一天平（日本島津公司）；UPT-II-10T 型純水儀（四川優普超純科技有限公司）

2 試劑

1-氟萘，購自成都科隆化學品有限公司；1-氟萘、1-萘胺、2-氟萘和萘對照品購于阿拉??；乙腈（色譜純，美國sigma 公司）；碳酸氫銨和三乙胺皆為分析純，購于成都科隆化學品有限公司，純水由優普超純水系統制備。

3 方法

3.1 溶液配制

空白溶劑：流動相。

系統適用性溶液：取1-氟萘、1-萘胺、2-氟萘和萘對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每1 mL 中各約含雜質10 μg 的溶液作為系統適用性試驗溶 液。

供試品溶液：取供試品約10 mg，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋到刻度，搖勻即 得。

1-氟萘定位溶液：取2 mg 1-氟萘對照品，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋到刻度，搖勻即得。

2-氟萘定位溶液：取2 mg 2-氟萘對照品，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋到刻度，搖勻即得。

1-萘胺定位溶液：取2 mg 1-萘胺對照品，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋到刻度，搖勻即得。

萘定位溶液：取2 mg 萘對照品，精密稱定，置 10 mL 量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋到刻度，搖勻即得。

自身對照溶液：取供試品溶液適量，定量稀釋制成含1-氟萘1 μg/mL 的溶液，搖勻即得。

3.2 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Gemini C18 250×4.6 mM，5 μm；流動相為10 mM 碳酸氫鈉+6 mM 三乙胺∶乙腈=55∶45，等度洗脫，采集時間為主峰的2 倍保留時間；柱溫為40 ℃；檢測波長為220 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL。

4 結果

4.1 專屬性考察

分別進樣空白溶液、對照溶液、樣品溶液、各定位溶液和系統適用性溶液進行專屬性考察，如圖1～ 8 所示。由色譜圖可知，空白溶液不干擾主峰和各雜質峰檢測，各峰間分離度良好，同時通過紫外圖譜分析，主峰和各雜質最大吸收波長均為210 nm，考慮到210 nm 為末端吸收，基線波動較大，最終選擇220 nm 作為檢測波長。

圖1 空白溶液典型圖譜Fig.1 Specificity of blank solution

圖2 系統適用性溶液典型圖譜Fig.2 Specificity of system suitability solution

圖3 供試品溶液典型圖譜Fig.3 Specificity of sample solution

圖4 1-氟萘定位溶液典型圖譜Fig.4 Specificity of 1-fluoronaphthalene solution

圖5 1-萘胺定位溶液典型圖譜Fig.5 Specificity of 1-naphthylamine solution

圖6 2-氟萘定位溶液典型圖譜Fig.6 Specificity of 2-fluoronaphthalene solution

圖7 萘定位溶液典型圖譜Fig.7 Specificity of naphthalene solution

圖8 對照溶液典型圖譜Fig.8 Specificity of self-control solution

4.2 系統適用性

分別進樣空白溶液、對照溶液和系統適用性溶液進行系統適用性考察，其中對照溶液連續進樣6 針。統計系統適用性中各峰分離度和連續進樣6 針對照品溶液主峰峰面積和保留時間的RSD 值。由結果可知，系統適用性中2-氟萘和萘的分離度最小，各間峰分離度均大于2.0，各峰理論板數均大于15 000，對稱因子均在0.85～ 0.97 之間；連續進樣6 針，主峰峰面積RSD 值為0.13%，保留時間的RSD 值為0.02%。

4.3 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

取各定位溶液逐級稀釋，當S/N ≥3 時即為檢測限，當S/N ≥10 時即為定量限。最后測得1-萘胺LOD 為0.002 μg/mL，LOQ 為0.006 μg/mL；萘LOD為0.002 μg/mL，LOQ 為0.005 μg/mL；2-氟萘LOD為0.002 μg/mL，LOQ 為0.007 μg/mL；1-氟萘LOD為0.003 μg/mL，LOQ 為0.008 μg/mL。表明方法具有很高的靈敏度。

4.4 線性與范圍

取系統適用性溶液作為線性儲備液，分別取0.1、0.2、0.5、1、1.5 和2 mL 線性儲備液，置10 mL 量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，搖勻即得系列線性溶液。微孔濾膜過濾后，照上述色譜條件進樣，以峰面積平均值（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，按最小二乘法進行線性回歸，如表1 所示。結果表明各雜質線性相關系數（R）均大于0.995 0，校正因子均在0.2～ 5.0 之間，可采用加校正因子的自身對照法進行雜質含量計算。

表1 各雜質線性與范圍及校正因子結果表Tab.1 Results of each impurity linearity,range and correction factor

4.5 重復性

取同一批號1-氟萘樣品（批號：20230101），按專屬性項下“供試品溶液”制備方法制備6 份供試品溶液和6 份自身對照溶液，同時進樣空白溶液和系統溶液，進行重復性試驗。根據樣品圖譜中各雜質峰面積，采用加校正因子的自身對照法計算1-萘胺、2-氟萘和萘最大未知單雜和總雜含量，6 份樣品檢出1-萘胺、2-氟萘和萘、最大未知單雜和總雜含量均值分別為0.000 7%、0.006%、0.038%、0.035%和0.081%，RSD 值均小于2.32%。

4.6 中間精密度

照重復性樣品制備方式制備各樣品，對于不同人員，不同日期和不同儀器進行試驗。結果表明，6 份樣品檢出1-萘胺、2-氟萘和萘最大未知單雜和總雜含量與重復性檢出結果相當，12 份樣品各雜質RSD 值均小于5.56%。結合重復性數據表明方法精密度良好。

4.7 回收率

取1-萘胺、2-氟萘和萘對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每1 mL 中各約含雜質10 μg 的溶液作為雜質儲備溶液。取10 mg 供試品9 份，精密稱定，分別置于不同10 mL 量瓶中，精密加入0.5 mL、1 mL 和1.5 mL 雜質儲備溶液，各濃度平行制備3份。如表2～ 4 所示，結果表明各雜質的回收率均在92.84%～ 103.72%之間，各雜質回收率RSD 均值均小于3.12%。表明方法準確度良好。

表2 1-萘胺回收率結果Tab.2 Recovery of 1-naphthylamine

表3 萘回收率結果Tab.3 Recovery of naphthalene

表4 2-氟萘回收率結果Tab.4 Recovery of 2-fluoronaphthalene

4.8 耐用性

改變不同流速、不同柱溫、不同批次色譜柱、不同緩沖鹽濃度和不同流動相比例來評估色譜條件微小變動時，各雜質檢測情況。如表5～ 6 所示，結果表明，不同耐用性條件下，各峰之間分離度均大于1.5，樣品檢出1-萘胺、2-氟萘和萘最大未知單雜和總雜含量均值分別為0.000 7%、0.006%、0.037%、0.036%和0.085%，RSD 值均小于6.82%。表明方法耐用性良好。

表5 耐用性分離度和相對保留時間結果表Tab.5 Resolution and relative retention time results of robustness

表6 耐用性雜質結果表Tab.6 Impurity results of robustness

4.9 樣品測定

采用擬定方法對3 批次樣品進行檢測，每批樣品平行制備兩份，統計各雜質檢出情況。如表7 所示，結果表明各批樣品各已知雜質和最大未知單雜均小于0.10%，總雜均小于0.20%。

表7 三批樣品雜質檢出結果表（n=3）Tab.7 Results of impurities in three batches（n=3）

5 討論

5.1 雜質控制限度確定

查詢CPDB 數據庫，1-萘胺為遺傳毒性雜質，其TD50 值為67.3 mg/kg/day[6]，計算PDE=67.3 mg/ kg/day*50 kg/5 000=67.3 μg/day，度洛西汀和達泊西汀的最大日劑量均為60 mg，計算限度為0.11%，收嚴至0.10%風險最小，2-氟萘和萘因不具有基因雜質警示結構，按照ICH M7 指導原則分類為第5 類雜質，按照一般雜質進行研究，參考ICH Q3A 按照0.10%限度進行研究。因本品為起始物料，若后續合成工藝對雜質有清除作用，也可根據加標清除情況適當放寬限度。

5.2 流動相體系的選擇

本品各雜質均含有萘的結構，紫外吸收較強，一般常用的流動相的體系為酸性磷酸鹽-乙腈體系[7]或質譜體系，參考文獻表明，度洛西汀[8]和達泊西汀[9]有關物質方法大多采用堿性流動相體系對雜質進行控制和研究，為保證起始物料1-氟萘能在度洛西汀和達泊西汀成品有關物質方法中能被有效檢出，故選擇堿性體系進行方法開發。通過對有機堿的選擇，最終選擇可以耐受高pH 的Phenomenex Gemini C18對1-氟萘雜質方法進行開發，最終選擇10 mM 碳酸氫鈉+6 mM 三乙胺∶乙腈=55∶45 作為流動相，主峰和雜質峰峰型較為對稱，理論板數較高，各峰分離度良好。

5.3 雜質計算方式的確定

本文建立的堿性RP-HPLC 加校正因子的主成分自身對照法可同時測定2-氟萘、萘和1-萘胺含量，通過統計不同耐用性條件下的各雜質的相對保留時間，表明不同耐用性條件下測得的相對保留時間具有較好的重現性，可以實現各已知雜質的準確定位，無需長期購買雜質對照品；通過標準曲線法計算各雜質斜率后再計算出各雜質的校正因子，在各已知雜質校正因子均在0.2～ 5.0 范圍內，通過加校正因子的自身對照法校正進行雜質計算，可在不采用外標法的情況下實現雜質含量的準確測定。其他未知雜質均按照不再乘以校正因子的計算方式進行計算。

6 結論

本文首次建立了堿性RP-HPLC 加校正因子的主成分自身對照法用于測定1-氟萘中雜質的含量，方法專屬性強、靈敏度高、操作簡便、重復性好、結果準確可靠，可用于1-氟萘中雜質的控制。