重組大腸桿菌全細胞催化法生產N-乙酰神經氨酸

鄭 蝶， 楊海泉， 夏媛媛， 沈 微， 陳獻忠*

（1. 江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

唾液酸是一系列9-碳單糖及其衍生物的統稱，最初從牛下頜唾液腺黏蛋白中分離得到[1]。 N- 乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）是唾液酸的主要種類之一，主要以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在[2-5]。 Neu5Ac 參與細胞識別、信號轉導、腫瘤發生等多個生理過程[6-8]，Neu5Ac 還可以作為合成抗流感病毒藥物的前體[9-11]，由于其具有重要的生物學功能，Neu5Ac 在醫藥和生物技術產業上的需求不斷增加[12]。

Neu5Ac 可以通過天然產物中提取、化學合成、微生物發酵、 酶法合成和全細胞生物催化來制備。Neu5Ac 傳統的生產方法主要從天然原料中獲得，如燕窩、牛奶或雞蛋等[13]，由于這些天然產物中唾液酸含量低，不適合進行大規模生產。 化學合成法反應條件苛刻，后期的分離純化復雜，無法滿足工業化生產的要求[14]。 利用發酵法生產Neu5Ac 成本較低，但產量不高，而且副產物較多，還未見有工業化生產報道[15]。 酶法生產Neu5Ac 具有轉化率高、反應時間短的優點，但由于酶法合成還需要進行細胞破碎和酶的純化等操作，且N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶需要ATP 作為活化劑，從而限制了生產規模的擴大[16-20]。 全細胞催化法是利用完整的細胞作為催化劑將底物轉化成產物，本質上也是利用生物體內酶的催化作用[21]。全細胞催化法因其操作簡便、經濟高效、產物易分離提純等優點，是一種較好的生產Neu5Ac 的方法[22]。

2011 年，Tao 等采用一鍋法將AGE 和NanA 兩種酶在大腸桿菌內共表達， 以GlcNAc 和丙酮酸為底物催化合成Neu5Ac，不僅提高了生產效率，簡化了工藝流程，還具有一定的經濟優勢[23]。2013 年，Lin等構建了共表達基因AGE和NanA的重組大腸桿菌E. coli△nanTEK/pNA， 催化N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc） 和丙酮酸合成240 mmol/L 的Neu5Ac[24]。 許楊等對工程菌E. coli△nanTEK/pNA 的細胞培養條件以及催化過程進行優化，以600 mmol/L GlcNAc 和800 mmol/L 丙酮酸作為底物， 在30 ℃下轉化16 h 得到294.4 mmol/L Neu5Ac，GlcNAc 轉化率可以達到49.1%[25]。 Chen 等利用基因工程技術平衡了AGE 和NanA 兩種酶的表達， 然后通過代謝工程改造底物和產物運輸途徑，進一步利用生物信息學方法和蛋白質工程分別提高了兩種酶的活性，最終利用構建的新型生物催化劑得到351.8 mmol/L 的Neu5Ac，GlcNAc 轉化率高達58.6%[26]。 2019 年，Zhao 等在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中共表達基因AGE和NanA，通過啟動子優化、關鍵酶篩選、N 端編碼序列工程促進關鍵酶表達和阻斷副產物途徑，開發了一種有效的食品級Neu5Ac 生產方法，Neu5Ac 的產量達到68.75 g/L，GlcNAc 轉化率為55.57%[27]。

目前全細胞催化法生產Neu5Ac 均以純度較高的GlcNAc 為底物，考慮到Neu5Ac 的生產成本和市場競爭性，不利于規?；a。 作者探索了通過發酵法生產GlcNAc 和生物催化法生產Neu5Ac 工藝偶聯的可行性。利用實驗室前期構建的高產GlcNAc重組菌和全細胞催化劑E. coli△NTE/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr）進行工藝組合催化生產Neu5Ac，并進一步優化催化條件，建立分離純化工藝，獲得高純度的Neu5Ac，為Neu5Ac 工業化生物催化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高產GlcNAc 的重組大腸桿菌ATLWX、重組E.coli△NTE/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr）：作者所在實驗室構建并保存；丙酮酸：上海麥克林生化科技有限公司；Neu5Ac、GlcNAc 和N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）：Sigma 公司； 酵母粉和蛋白胨： 英國OXOID 公司；凝膠陰離子樹脂HZ-201：上海華震科技有限公司；其他藥品和生化試劑：國藥化學試劑有限公司。

種子培養基（組分g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5；pH 7.0。 平板培養基加瓊脂20。

發酵培養基（組分g/L）：葡萄糖10，（NH4）2SO46.17，KH2PO47，Na2HPO47，檸檬酸2，MgSO4·7H2O 3。

微量元素（組分mg/L）：CaCl2·2H2O 60，MnSO4·H2O 10，ZnSO4·7H2O 3，FeSO4·7H2O 50，ALCl3·6H2O 5，Na2MoO4·2H2O 3，CoCl2·6H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，硼酸0.5。

LB 培養基（組分g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

1.2 儀器與設備

5 L 機械攪拌玻璃發酵罐： 上海百侖生物科技有限公司；高效液相色譜安捷倫1260：德國安捷倫公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州凈化集團安泰公司； 自動高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3750）： 日本SANYO 公司；臺式高速冷凍離心機（4K-15）：德國Sigma 公司；蛋白電泳儀：美國Bio-Rad 公司；紫外可見分光光度計（UV-2000）：尤尼柯（上海）儀器有限公司；pH 計（FE28-Meter）：梅特勒-托利多儀器有限公司；恒溫振蕩培養搖床（HYG-A）：江蘇太倉市實驗設備廠；生物傳感分析儀（SBA-40C）：山東省生物研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組E. coli ATLWX 發酵生產N-乙酰葡萄糖胺

1）一級種子液培養 從平板挑取單菌落接種至含有對應抗性的20 mL LB 培養基中，于32 ℃搖床中200 r/min 培養12 h。

2）二級種子液培養 種子培養液培養后，以接種體積分數1%轉接到含有對應抗性的50 mL LB培養基中，34 ℃、200 r/min 培養6 h 至OD600為2.5～3.3。

3）分批補料發酵培養 二級種子液以接種體積分數16%接入5 L 發酵罐，裝液量2.5 L，發酵溫度34 ℃，葡萄糖的初始添加量10 g/L，發酵過程中待初始糖濃度低于2 g/L 時， 手動補加體積分數70%的葡萄糖， 控制殘糖在2～5 g/L， 當OD600達到55 后，升溫至37 ℃，控制殘糖在0.2～0.5 g/L，發酵過程中通過自動補加氨水調節pH 為6.9，關聯轉速從200 r/min 到850 r/min。 調節溶氧在體積分數10%左右， 發酵過程中每隔一定時間取樣測定葡萄糖質量濃度和細菌生長情況。

1.3.2 產物和中間產物的檢測 GlcNAc、ManNAc和Neu5Ac 濃度的測定：采用高效液相色譜測定，樣品前處理方法及檢測方法參照文獻[28]。

1.3.3 N-乙酰葡萄糖胺發酵液的處理 發酵得到的發酵液經過離心除菌后， 于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4 重組菌的培養及誘導 將-80 ℃甘油管保存的大腸桿菌在卡那霉素（50 mg/L）抗性LB 固體平板上劃線，接種單菌落到20 mL 含有對應抗性的培養基中，37 ℃、200 r/min 培養10 h。 取1 mL 種子液轉接到50 mL 含有對應抗性的培養基中， 在37 ℃搖床中繼續培養至OD600為0.6～0.8 時，加入1 mmol/L IPTG，然后在28 ℃低溫誘導8 h。

1.3.5 SDS-PAGE 驗證重組蛋白質表達 誘導結束后，離心收集菌體。加一定量的H2O 調節OD600為2.0， 加入5×SDS 凝膠加樣緩沖液后混勻，100 ℃加熱10 min，10000 r/min 離心3 min。 取10 μL 上清液電泳，考馬斯亮藍R250 對樣品染色，染色50 min后， 脫色液脫色3 h， 用含有空載體pET-28a 的E.coli BL21（DE3）作為對照。

1.3.6 全細胞催化制備Neu5Ac 重組菌經誘導后， 用冷凍離心機在4 ℃、7000 r/min 離心5 min，收集菌體， 用pH 7.5，100 mmol/L Tris-HCL 緩沖液洗滌2 次，再次收集菌體。

將收集的菌體重懸于含有0.28 mol/L GlcNAc、一定濃度的丙酮酸、一定濃度的表面活性劑、pH 為6.5，100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液的轉化體系中，轉化溫度為30 ℃， 每隔一定時間取樣并用NaOH 調節pH 為7.5。

1.3.7 全細胞催化制備Neu5Ac 的條件優化 分別在不同菌體，OD600（10、20、30、40、50）、不同丙酮酸濃度（0.83、1.10、1.38、1.65、1.93、2.20 mol/L）、不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同Triton X-100 的添加量（體積分數0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）和不同溫度（20、30、37、40、50 ℃）條件下進行全細胞轉化，通過高效液相色譜檢測Neu5Ac 的產量。

1.3.8 Neu5Ac 的分離純化

1）Neu5Ac 溶液的制備 將反應轉化液離心除菌后，先用活性炭進行脫色，然后用醋酸調節至pH 4.5 左右，上清液過陰離子樹脂柱。

2）陰離子交換樹脂處理步驟 分別用1 mol/L NaOH 溶液和去離子水沖洗樹脂， 直至流出液pH值為8～9，接著用1 mol/L 的HCl 溶液、去離子水沖洗樹脂， 直至流出液pH 值為5～7， 繼續用1 mol/L的NaOH 溶液活化樹脂層， 將樹脂轉為氫氧根型，最后用去離子水洗至pH 為7～9。

3）陰離子樹脂對Neu5Ac 溶液的動態吸附洗脫將處理好的陰離子樹脂HZ-201400 mL 以濕法裝入層析柱， 將待純化的含Neu5Ac 的樣品溶液調節pH 至4.5 上樣，上樣后用1 個柱體積的去離子水洗去無法結合的物質， 然后用0～0.65 mol/L 甲酸線性洗脫，洗脫液用EP 管收集，每管7 mL，用HPLC 檢測收集樣品中Neu5Ac 的濃度。

4）Neu5Ac 晶體的制備 洗脫液經旋轉蒸發濃縮至Neu5Ac 質量濃度為150 g/L 左右，加入7 倍體積的異丙醇，4 ℃放置2 d，使Neu5Ac 結晶。 通過真空泵抽濾液體，得到的晶體用60 ℃烘箱烘至質量恒定。

2 結果與分析

2.1 重組菌E. coli/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr）的誘導表達

誘導表達重組菌E. coli/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr）后，SDS-PAGE 電泳見圖1。相比對照菌株，重組菌在約40000、33000 處有較粗的條帶， 說明兩個重組蛋白AGE 和NanA 均成功表達。

圖1 重組菌E. coli/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr） 表達AGE 和NanA 蛋白質電泳分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of expression of AGE and NanA by recombinant E. coli/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr）

2.2 制備N-乙酰葡萄糖胺發酵液

以E. coli ATLWX 作為出發菌株， 在5 L 發酵罐中補料分批發酵生產N-乙酰葡萄糖胺。 葡萄糖的初始質量濃度為10 g/L， 發酵溫度為34 ℃時，重組E. coli 在10 h 后葡萄糖幾乎消耗完， 之后開始補加葡萄糖，控制殘糖質量濃度在2～5 g/L。 當發酵16 h 時，OD600達到55，提高發酵溫度至37 ℃，控制殘糖質量濃度在0.2～0.5 g/L；發酵34 h 后菌體濃度趨于穩定，產量增長變緩；當發酵45 h 時，菌體濃度OD600達到135，GlcNAc 產量達到61 g/L， 發酵過程中pH 隨著時間緩慢增加，見圖2。

圖2 重組E. coli ATLWX 發酵生產GlcNAcFig. 2Production of GlcNAc by fermentation of recombinant E. coli ATLWX

2.3 以GlcNAc 發酵液為底物進行全細胞催化

重組菌E. coli ATLWX 發酵得到的發酵液經過離心除菌后，于-20 ℃冰箱保存備用。為進一步測定E. coli 全細胞催化含有GlcNAc 的發酵液合成Neu5Ac 的能力，收集誘導后的菌體，以0.28 mol/L（約60 g/L）GlcNAc 為底物，加入0.74 mol/L 丙酮酸鈉和質量分數0.2% Triton X-100 進行全細胞轉化。由圖3 可以看出，當反應36 h 時，Neu5Ac 產量達到44.5 mmol/L，轉化率為16.18%，表明以含有GlcNAc的發酵液為底物進行全細胞轉化是可行的。

圖3 重組E. coli 全細胞催化GlcNAc 發酵液合成Neu5Ac Fig. 3 Synthesis of Neu5Ac from GlcNAc using recombinant E. coli whole cells

2.4 以發酵液為底物進行全細胞催化的條件優化

2.4.1 細胞濃度對Neu5Ac 的影響 在實際應用中為了保證一定的生產效率和經濟效益，因此，需要控制菌體濃度在合適范圍內[29]。 在轉化液初始pH為7.5， 反應溫度為30 ℃，GlcNAc 濃度為0.28 mol/L，丙酮酸濃度為0.74 mol/L，Triton X-100 的體積分數為0.2%，菌體OD600分別為10、20、30、40、50 的條件下進行全細胞催化反應。 從圖4 可以看出，轉化體系OD600在10～30 時，Neu5Ac 產量隨菌體濃度的增大而增加，主要是因為菌體濃度越高，酶量越多，對應產量就會越高，當菌體濃度大于30 時，產量反之減少，主要是因為菌體濃度過高，轉化體系黏度增大， 影響了底物和產物的傳質， 當轉化體系菌體OD600為30 時，Neu5Ac 產量最高，達到42.8 mmol/L，轉化率為15.57%，因此，選擇菌體濃度OD600為30進行后續實驗。

圖4 菌體OD600 對重組E. coli 全細胞催化合成Neu5Ac 的影響Fig. 4 Effects of cell concentration on synthesis of Neu5Ac using recombinant E. coli whole cells

2.4.2 丙酮酸濃度對Neu5Ac 的影響 丙酮酸是全細胞催化的底物之一，因此，其濃度高低對Neu5Ac的合成有影響。 保持其他條件不變的情況下，控制丙酮酸濃度分別為0.83、1.10、1.38、1.65、1.93、2.20 mol/L （GlcNAc 和丙酮酸濃度比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8）進行全細胞催化反應，考察不同丙酮酸濃度對合成Neu5Ac 的影響。從圖5 可以看出，當丙酮酸濃度為1.10 mol/L 時，Neu5Ac 的轉化率僅有17.27%； 當丙酮酸濃度增加到1.65 mol/L 時，產量為75.9 mmol/L，轉化率提高到27.6%；繼續增加丙酮酸濃度，產量幾乎不變，這可能是因為高摩爾濃度的丙酮酸會抑制N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶的活性[30]，從而導致產量不再增加。由于添加過量的丙酮酸不僅會發生底物抑制作用， 還會增加后期的分離純化難度，因此，選擇1.65 mol/L 的丙酮酸進行后續實驗。

圖5 丙酮酸摩爾濃度對重組E. coli 全細胞催化合成Neu5Ac 的影響Fig. 5 Effects of pyruvate concentrations on synthesis of Neu5Ac using E. coli whole cells

2.4.3 轉化液起始pH、 表面活性劑添加量對Neu5Ac 的影響 pH 可以通過影響酶的活性來影響Neu5Ac 的合成，因此，作者考察了不同轉化液起始pH 對合成Neu5Ac 的影響。 保持其他條件不變，在轉化液初始pH 分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的條件下進行全細胞催化反應，結果見圖6（a）。 隨著pH的升高，Neu5Ac 的產量先增加后減少，當pH 為6.5時， 產量最高， 達到97.16 mmol/L， 轉化率為35.33%， 說明偏酸性的條件更有利于Neu5Ac 的合成。原因可能是細胞質的pH 為中性，在微酸性條件下，由于細胞膜內外pH 不同產生的電位差，促進了ATP 合成[31]，ATP 又可以作為N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構酶的活化劑進一步促進Neu5Ac 的合成，因此，后續選擇轉化液起始pH 為6.5 進行實驗。 表面活性劑可以改變細胞膜的通透性從而有利于底物的進入和產物的流出，因此研究了不同表面活性劑的添加量對全細胞催化合成Neu5Ac 的影響，結果如圖6 （b）。 當Triton X-100 添加質量分數小于0.4%時，對Neu5Ac 的合成影響不大；當Triton X-100 添加質量分數0.4%時， 產量最高， 達到102.5 mmol/L，轉化率為37.3%；繼續提高Triton X-100 添加量，Neu5Ac 的產量略微有所下降， 可能是由于Triton X-100 質量分數的增加導致轉化體系中的含氧量降低，從而降低了重組大腸桿菌的生理活性[32]，因此，選擇表面活性劑添加質量分數0.4%進行后續實驗。

圖6 轉化液起始pH、 表面活性劑添加量對重組E. coli 全細胞催化合成Neu5Ac 的影響Fig. 6 Effects of initial pH，concentrations of surfactant added on synthesis of Neu5Ac using E. coli whole cells

2.4.4 溫度對生產Neu5Ac 的影響 溫度對酶活也有一定的影響，因此作者考察了不同溫度對全細胞合成Neu5Ac 的影響。 保持其他條件不變， 分別在20、30、37、40、50 ℃下進行全細胞催化反應。 從圖7可以看出，在溫度低于30 ℃時，Neu5Ac 的產量隨溫度的升高而上升， 溫度為30 ℃時產量最高，為103.4 mmol/L，轉化率為37.6%。 溫度超過30 ℃時，產量隨溫度的上升而下降。 當反應溫度為50 ℃時，產量只有27.3 mmol/L。 由此可見， 反應溫度對Neu5Ac 的合成影響較大。 這可能是由于溫度過高，酶的空間結構發生改變，導致酶活力下降。 因此，后續采用30 ℃進行全細胞催化。

圖7 溫度對重組E. coli 全細胞催化合成Neu5Ac 的影響Fig. 7 Effects of temperature on synthesis of Neu5Ac using E. coli whole cells

2.5 正交實驗優化全細胞催化生產Neu5Ac 條件

在單因素實驗基礎上，綜合考察各種因素對生產Neu5Ac 的影響，選擇菌體OD600、丙酮酸濃度、表面活性劑添加質量分數3 個因素進行三因素三水平正交實驗，各因素水平安排見表1。

表1 全細胞催化條件優化正交實驗因素水平Table 1 Factor levels of whole cell catalytic conditions optimized orthogonal test

對正交實驗結果進行極差分析，通過極值的大小可以反映出各因素對Neu5Ac 產量的影響程度。通過表2 可知， 菌體濃度對Neu5Ac 產量的影響最大，其次為表面活性劑的添加量，丙酮酸濃度對產量影響最小，結合表3 的方差分析結果，確定三因素的最佳組合為A2B1C3，即菌體濃度為30，丙酮酸濃度為1.38 mol/L，表面活性劑添加質量分數0.4%。采用此條件進行全細胞催化實驗， 反應48 h 后，Neu5Ac 產量為（141±3） mmol/L，轉化率為（51.27±1.09）%。

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

2.6 全細胞催化在發酵罐上進行放大

為高效利用重組E. coli/pET28a-（T7-shnal）-（tac-slr）全細胞催化生產Neu5Ac，按照正交實驗優化后的條件，在發酵罐中進行全細胞催化反應的放大。在5 L 發酵罐中，催化條件為：反應溫度為30 ℃，初始pH 為6.5，GlcNAc 濃度為0.28 mol/L， 丙酮酸濃度為1.38 mol/L，Triton X-100 添加質量分數0.4%，菌體OD600為30，進行全細胞轉化，并用高效液相色譜檢測轉化液中各組分濃度。 從圖8 可以看出，在反應前期，隨著反應的進行，底物GlcNAc 濃度不斷下降，產物Neu5Ac 濃度逐漸上升；反應70 h時，Neu5Ac 產量最高， 為180 mmol/L， 轉化率為65.45%，比優化前提高了49.27%。

圖8 在5 L 發酵罐中重組E. coli 全細胞催化合成Neu5AcFig. 8 Synthesis of Neu5Ac using E. coli whole cells in 5 L fermentor

2.7 Neu5Ac 的分離純化

全細胞轉化后的轉化液經過脫色處理后，將濃度為42 mmol/L 的Neu5Ac 溶液在陰離子樹脂上進行上樣，先經過水洗脫，然后用0～0.65 mol/L 的甲酸線性洗脫，洗脫曲線見圖9（a）。 隨著甲酸濃度的增加， 洗脫液中Neu5Ac 的濃度也不斷增加， 含有Neu5Ac 的洗脫液主要集中在0.8～1.1 L， 甲酸摩爾濃度在0.1～0.6 mol/L 時， 洗脫液中Neu5Ac 濃度較高。 因此，后續實驗選擇0.6 mol/L 的甲酸作為洗脫液。

圖9 Neu5Ac 的洗脫曲線及Neu5Ac 標品和結晶樣品的HPLC 圖譜Fig. 9 Elution curve of Neu5Ac and HPLC chromatogram of Neu5Ac standard and crystal sample

將含有Neu5Ac 的洗脫液進行濃縮和結晶處理后，得到Neu5Ac 晶體0.44 g，結晶回收率為42.5%，將純化得到的Neu5Ac 樣品和Sigma 公司的Neu5Ac 標品用HPLC 分析，Neu5Ac 標樣和樣品出峰時間一致，純度為98.3%，見圖9（b）。

3 結語

全細胞催化法作為一種操作簡單、 副產物少，且反應條件溫和、污染低的生產方法，相比其他生產工藝具有明顯優勢，更適合大規模生產。 現階段，全細胞生物催化法生產N-乙酰神經氨酸需要添加昂貴的N-乙酰葡萄糖胺作為前體物， 為了降低成本， 作者以含有N-乙酰葡萄糖胺的發酵液為底物進行全細胞催化，通過對催化條件進行優化，在菌體OD600為30、丙酮酸添加量為濃度1.38 mol/L、轉化液起始pH 為6.5、Triton X-100 的添加質量分數為0.4%、 反應溫度為30 ℃的條件下，Neu5Ac 的產量可以達到180 mmol/L，轉化率達65.45%，比優化前提高了49.27%。反應后的轉化液經脫色后過陰離子樹脂，洗脫液經濃縮、結晶后得到了較為純凈的Neu5Ac，HPLC 檢測分析其純度為98.3%，該生產工藝經濟、高效，為Neu5Ac 連續工業化生產提供了參考。 本研究中全細胞催化生產Neu5Ac 在70 h 產量達到最高，轉化過程中隨著時間的延長，細胞的活性和理狀態也會發生改變。 因此，可以通過優化轉化液的組成提高細胞的生理活性來進一步提高Neu5Ac 的產量。