青春雙歧桿菌凍干保護劑篩選及高密度凍干工藝優化

潘子怡， 陳則華， 毛丙永， 唐 鑫， 寧初光，李文治， 崔樹茂*， 趙建新， 陳 衛

（1． 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2． 無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510405）

雙歧桿菌廣泛分布于動物和人類的腸道中，在維持宿主健康方面發揮重要作用[1]。 青春雙歧桿菌CCFM8630 分離自老年人腸道， 已被證實具有降血糖和緩解代謝綜合征[2]、延緩代謝紊亂的發展[3]、減輕高脂高膽固醇膳食誘發的非酒精性脂肪肝損傷[4]等作用，因此具有潛在的應用價值。 益生菌菌株的潛在應用要求開發出最優的工藝用于商業用途。 然而，大多數益生菌培養物需要冷藏儲運，成本高昂且不方便使用。 益生菌粉的穩定性較好，儲運成本較低且便于使用，同時雙歧桿菌在較低的水分活度下，貯藏期間的生存力往往會增強[5]。

目前， 制備菌粉最有效的方式為真空冷凍干燥，可以有效維持菌粉的長期穩定性[6]。 通過將水分活度降低到0.2 或更低， 減少益生菌活力和功能的損失，可以確保0 ℃以下條件下儲存的質量。 冷凍干燥的存活率主要受到凍干保護劑[7]、細胞的生理狀態[8]、凍結速度、冷凍干燥參數[9]、復水條件和初始細胞濃度等因素的影響。 為減少凍干對菌株損傷，通常會加入保護劑[10]。 不同的菌株具有不同的凍干特性，為菌株選擇合適的保護劑是非常重要的，有利于在凍干和貯藏過程中提高它們的存活率。

在常規分批培養過程中，青春雙歧桿菌培養密度通常較低[11]，其高度厭氧、凍干存活率低等特性導致其工業化生產效率低，因此，迫切需要一種更高效的凍干方式。 高密度凍干是指通過提高菌液與凍干保護劑的比例以提高凍干產量并減少能耗，然而減少保護劑的比例可能會降低凍干的可行性。 因此，作者根據所獲得的青春雙歧桿菌CCFM8630 的最佳凍干保護劑配方，對冷凍干燥中菌泥干物質比例及樣品質量進行調整，最終獲得了最佳的高密度冷凍干燥工藝。

1 材料與方法

1.1 菌株

青春雙歧桿菌 CCFM8630 （Bifidobacterium adolenscentis CCFM8630）： 由江南大學食品微生物菌種保藏中心保藏。

1.2 試劑

胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸粉、葡萄糖、乙酸鈉、吐溫80、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；赤蘚糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、山梨糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、麥芽糖醇、棉籽糖、水蘇糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、甘露低聚糖、麥芽糊精、菊粉、抗性糊精、膠原蛋白、乳清蛋白、脫脂乳：創賽生物科技有限公司。

1.3 培養基與緩沖液配制

MRS 培養基：胰蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，吐溫801 mL，磷酸氫二鉀2.0 g， 檸檬酸二銨2.0 g， 七水硫酸鎂0.1 g，一水硫酸錳0.05 g，半胱氨酸鹽酸鹽1 g，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.4，115 ℃滅菌20 min。

半胱氨酸磷酸鹽緩沖液（CYS 緩沖液）：半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，磷酸氫二鈉6.0 g，磷酸二氫鉀4.5 g，氯化鈉4.0 g， 吐溫800.6 mL， 蒸餾水1 L，pH 6.8～7.0，115 ℃滅菌20 min。

1.4 儀器與設備

厭氧工作站AW500SG-7152：英國依萊泰科公司；pH 計、電子天平EL3002：梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司； 渦旋振蕩器MS-3-basic： 德國IKA 公司； 高溫高壓滅菌鍋MLS-3750： 日本SANYO 公司；超凈工作臺ZHJH-C1115B：上海智誠分析儀器制造有限公司；凍干機LYOBETA-5PS：西班牙Telstar 公司；落地式離心機RC-BIOS10：賽默飛世爾公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌株活化與培養 取-80 ℃冰箱中凍藏的青春雙歧桿菌CCFM8630，在MRS 固體平板上用接種環劃線接種純化，37 ℃厭氧培養36～48 h，挑取單菌落轉移至5 mL 新的液體培養基中，37 ℃厭氧生長24 h，再以接種體積分數4%傳代至新的液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h， 連續活化3～5 次作為種子培養液。

1.5.2 青春雙歧桿菌的凍干 將青春雙歧桿菌在37 ℃厭氧培養至穩定，4 ℃以8000 g 離心15 min，取菌泥。 為獲得菌懸液，將菌泥與無菌CYS 緩沖液以1∶1 的質量比混勻，并將pH 調至大約6.5，再以1∶1 的體積比將菌懸液與冷凍干燥保護劑混勻，加1 mL 至西林瓶中，按以下程序進行凍干：在10 min內將層板溫度降至-4 ℃后再降至-50 ℃預凍，維持1 h；在一次干燥時，降低真空度，將層板在1 h 內加熱到-30 ℃， 并且為了去除游離水在20 Pa 的真空下運行18 h；在二次干燥時，將層板的溫度控制在1 h內加熱至25 ℃，連續16 h 控制在2 Pa 的條件下。

1.5.3 單一冷凍干燥保護劑的配方 將各種冷凍干燥保護劑如糖（醇）類、蛋白質類等按一定比例稱量，溶于水中，制成200 g/L 的溶液。

1.5.4 復合冷凍干燥保護劑的配方 每一種復合保護劑的質量濃度均為200 g/L，分別為：1）復合糖類冷凍干燥保護劑溶液， 每種糖的質量濃度是100 g/L；2）復合糖類與蛋白質類冷凍干燥保護劑溶液，糖類冷凍干燥保護劑與蛋白質類冷凍干燥保護劑質量濃度分別為100 g/L；3）其他小分子冷凍干燥保護劑復配的最佳復配冷凍干燥保護劑，分別加入MnSO410 g/L、MgSO420 g/L、抗壞血酸30 g/L、谷胱甘肽15 g/L、L-酪氨酸15 g/L、甜菜堿0.4 g/L。

1.5.5 青春雙歧桿菌凍干前菌懸液的高密度優化將青春雙歧桿菌的菌泥置于烘箱中干燥，稱得干物質的質量并計算以確定每克菌泥中干物質含量。 按照質量比1∶1、1∶2 對干物質與保護劑進行混合，制備質量分數15%、20%、25%的菌懸液， 混勻后吸取1 mL 至西林瓶。

1.5.6 單位質量菌粉活菌數與凍干存活率的測定將菌泥與保護劑按比例混合，立刻取樣通過傾注計數法測定凍干前活菌濃度（CFU/mL），另吸取1 mL至凍干瓶，快速放入凍干機進行真空冷凍干燥。 稱得凍干后樣品的質量，重新溶解在無菌水中至凍干前體積，計數后得到凍干后活菌濃度（CFU/mL），計算單位質量菌粉活菌數（CFU/g）與凍干存活率。

式中：S 為凍干存活率，%；N0為凍干前活菌濃度，CFU/mL；N1為凍干后活菌濃度，CFU/mL。

1.6 數據分析

每組實驗設置3 個平行， 用Excel 軟件計算數據的平均值和標準偏差， 采用軟件SPSS 22.0 進行數據差異分析， 采用單因素方差分析（ANOVA）和DUNCAN 多重比較完成差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同糖與蛋白質類保護劑對青春雙歧桿菌的凍干保護特性分析

按照保護劑的滲透性特點或物理化學性質來進行劃分，根據其滲透性特點劃分成3 類：1）可以同時滲透進微生物的細胞膜和細胞壁的化學物質，例如甘油， 它可以有效增強微生物細胞膜的流動性，并能與水結合從而有效抑制細菌過度脫水以及抑制冰晶形成[12]，但甘油會使得冷凍干燥產品黏度升高，所以不常使用[13]；2）一類只能透過微生物細胞壁不能穿過微生物細胞膜的化學物質，也被稱為半滲透類保護劑，其中有小分子糖，如海藻糖[14]、甘露糖[15]、蔗糖[16]等。 小分子糖類的游離端帶有一個負電荷的羥基自由基，能與蛋白質中的極性基團和微生物細胞膜上的磷脂形成氫鍵，產生相互作用，為細菌菌體提供保護作用，在冷凍干燥之前誘導細胞壁細胞質的分離，在微生物細胞膜與細胞壁之間建立起緩沖層[17]，從而起到保護菌體的作用；3）不能透過細胞壁和細胞膜的化學物質，在細胞表面形成保護殼，阻止細胞與冰晶和氧氣的接觸[18]。

目前， 還沒有針對青春雙歧桿菌凍干保護劑系統分析的報道，因此作者將常用的糖（醇）類、蛋白質類冷凍干燥保護劑按照其結構特點進行分類， 系統研究不同冷凍干燥保護劑的凍干保護效果，見表1。

表1 青春雙歧桿菌在不同種類保護劑中的凍干存活率Table 1 Freeze-drying survival rate of B. adolescentis in different protectants

由表1 可以看出，沒有凍干保護劑時，青春雙歧桿菌的凍干存活率僅為 （1.89±0.15）%， 添加糖（醇）類保護劑后，大部分的凍干存活率較空白組均有提高，同時糖（醇）類比蛋白類的保護效果好；四糖以下的小分子（除赤蘚糖醇外）均有較好的保護作用， 其中棉籽糖和山梨糖醇的保護效果最好，凍干存活率分別為（40.12±7.08）%、（41.59±5.83）%。在凍干過程中，從細菌細胞中去除結合水會導致表面蛋白質、細胞壁和細胞膜的損傷。 研究發現，細胞膜的脂質部分是凍干過程中損傷的主要區域，其中可能發生脂質過氧化[19]。因此，凍干保護劑應集中于最小化凍干過程中的細胞膜損傷。 研究表明，山梨糖醇可以通過相互作用來防止膜損傷，并穩定蛋白質的結構和功能[20]，同時能夠保護細胞膜的不飽和脂肪酸，減少由于ROS 清除導致的脂質過氧化，從而保護細胞免受氧化損傷[21]；棉籽糖作為半滲透類保護劑，其保護作用主要作用于細胞膜上，這可能是山梨糖醇與棉籽糖優于其他保護劑的主要原因之一。 綜上，半滲透類保護劑對青春雙歧桿菌的凍干保護效果最優，不滲透類保護劑次之，可滲透類保護劑的保護效果最差。

2.2 不同結構的糖類保護劑復配對青春雙歧桿菌凍干存活的影響

一般來說，每種保護劑都有自己的缺點，可復配其他保護劑來彌補。 按照一定的比例復配不同效果的保護劑，從而實現更好的凍干保護效果[21]?？紤]到棉籽糖及山梨糖醇對青春雙歧桿菌具有較好的凍干保護效果，因此，將兩者按照一定比例混合來進一步優化凍干保護劑，研究其對細菌菌體的凍干保護效果。

從圖1 可以看出，與單一保護劑相比，山梨糖醇與棉籽糖復配可以明顯提高凍干存活率， 達到（56.03±1.82）%。由于山梨糖醇與棉籽糖的保護機制不盡相同，兩種保護劑的復配從不同方面保護了青春雙歧桿菌，減少了凍干過程中的損傷。

圖1 青春雙歧桿菌在糖類復合冷凍干燥保護劑中的凍干存活率Fig. 1 Freeze-drying survival rate of B. adolescentis in carbohydrate compound protectant

2.3 糖類保護劑復配蛋白質對青春雙歧桿菌凍干存活的影響

糖類和蛋白質類保護劑對細菌菌體的保護機理并不相同，所以其保護效果也有一定差異。 盡管前面的實驗已經證明蛋白質類保護劑對青春雙歧桿菌的保護效果比其他保護劑差，將非滲透類保護劑與滲透類保護劑復配后會提高滲透類保護劑的玻璃化溫度，延遲結晶從而提高玻璃態無定形基質的穩定性[22]。因此，復配糖類與蛋白質類保護劑的效果應優于單一保護劑。

由圖2 可以看出，添加蛋白質類保護劑不會顯著提高復合保護劑的保護效果，當山梨糖醇、棉籽糖與乳清蛋白以質量比3∶1 復合時， 凍干存活率為（60.80±5.09）%，但與糖類復合保護劑并沒有顯著性差異。 說明糖類復合保護劑（山梨糖醇+棉籽糖）為最優保護配方。 然而，如果保護劑配方中只有糖類物質，會導致凍干樣品品質較差、容易結塊，因此考慮到實際生產應用，將添加乳清蛋白的糖類復合保護劑 （糖類與蛋白類質量比為3∶1） 作為優勢保護劑，進行后續研究。

圖2 青春雙歧桿菌在復配蛋白類保護劑中的凍干存活率Fig. 2 Freeze-drying survival rate of B. adolescentis in the compound of protein protectants

2.4 復合保護劑復配其他類小分子物質對青春雙歧桿菌凍干存活的影響

除常見的糖（醇）類、蛋白質類保護劑外，許多小分子物質如硫酸錳、抗壞血酸、谷胱甘肽等也有一定的凍干保護效果。 硫酸錳作為保護劑中的緩沖鹽，屬于滲透類保護劑，可調節菌體內部的理化平衡，也可與保護劑中的其他成分協同保護細菌[23]；抗壞血酸作為常用的抗氧化劑，可以延緩膜磷脂的氧化[24]；谷胱甘肽通過減少細胞膜脂肪酸的氧化，提高細胞膜中不飽和脂肪酸的比例來保護微生物，同時也可以改善凍干過程中細胞膜的流動性[25]；相容性溶質（如L-酪氨酸等）可以從培養基進入細胞作為胞內緩沖液；甜菜堿常作為相容性溶質添加至培養基中提高菌株的抗性，但作為凍干保護劑在干燥過程中能穩定蛋白質和細胞膜。 因此，作者以這些小分子物質復配前期得到的優勢凍干保護劑，進一步研究其對青春雙歧桿菌凍干存活率的影響，見圖3。

圖3 青春雙歧桿菌在復配其他小分子保護劑中的凍干存活率Fig. 3 Freeze-drying survival rate of B. adolescentis in the compound of other small molecules

由圖3 可以看出，將復合保護劑與已報道的其他小分子復配后保護效果并不會變好， 與硫酸錳、硫酸鎂、抗壞血酸、谷胱甘肽復配后凍干存活率反而顯著下降， 與甜菜堿復配后凍干存活率略有提高，為（62.21±5.02）%，但與前期研究得到的最優保護劑效果沒有顯著差異，說明這些物質對不同菌株有不同的保護特性。

2.5 雙歧桿菌的高密度凍干優化

提高保護劑與菌泥的比值可以提高細菌的凍干存活率，但凍干菌粉的產量會隨之下降。 因此，為順應實際工業生產的需要， 需要采用高密度凍干。目前工業生產中，凍干樣品干物質總質量分數通常在15%～20%，作者為了降低生產成本、提高產量，設定干物質總質量分數分別為15%、20%、25%的菌懸液樣品，每組樣品設定2 個菌泥干物質與保護劑的比例，探究在保證活菌數條件下進一步提升凍干樣品的濃度，見表2。

表2 青春雙歧桿菌在不同高密度凍干方案中的存活率及活菌數Table 2 Survival rate of B. adolescentis in different high density freeze-drying schemes

保護劑由山梨糖醇、棉籽糖與乳清蛋白組合而成，質量比為3∶3∶2。 凍干樣品的初始活菌數會影響凍干存活率，過高或過低都不利于凍干存活[26]。這與本研究結果一致，即適當提高凍干前活菌數，有利于菌株的存活。 對于相同的菌懸液中的干物質質量分數，當其中干物質與冷凍干燥保護劑的質量比為1∶1.2 時，CCFM 8630 凍干存活率相對更高。 表明在凍干過程中，略高于菌泥干物質的凍干保護劑的量能夠更好地保護細胞。 綜上，菌泥中干物質與冷凍干燥保護劑的質量比為1∶1.2，樣品中干物質總質量分數為25%，是青春雙歧桿菌的最優高密度凍干方案。

3 結語

作者通過單因素法對青春雙歧桿菌的最適凍干保護劑特性進行探究，發現糖（醇）類保護劑的保護效果優于蛋白質類保護劑，相對分子質量在五碳糖與三糖之間的糖類對青春雙歧桿菌凍干保護效果普遍較好，四碳糖赤蘚糖醇幾乎沒有凍干保護效果。 進一步復配糖（醇）類保護劑、糖（醇）類保護劑及蛋白質類保護劑、 以及與其他小分子保護劑復配， 發現質量比1∶1 的山梨糖醇與棉籽糖混合后制得的保護劑溶液的凍干保護效果最好，凍干存活率為（56.03±1.82）%，復合保護劑中添加蛋白質類保護劑與其他小分子類保護劑對青春雙歧桿菌的保護效果并沒有顯著區別。 從工廠生產和實際應用角度看，青春雙歧桿菌的最優冷凍干燥保護劑配方為質量比為3∶1 復配的糖類復合保護劑與乳清蛋白。 在保證活菌數的情況下，實現青春雙歧桿菌的高密度凍干，最優凍干方案為：山梨糖醇、棉籽糖與乳清蛋白以質量比3∶3∶2 復配得到冷凍干燥保護劑溶液，與菌泥中干物質以質量比1.2∶1 混勻， 樣品中干物質總質量分數為25%，此時青春雙歧桿菌的凍干存活率高達（77.08±5.20）%。