酶促擠壓對藜麥理化性質的影響

范金旭， 王 靜， 薛 玉， 周中凱

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

藜麥（Chenopodium quinoa）原產于南美洲安第斯山脈地區，在當地有7000 余年的種植歷史，是印第安土著的傳統食物[1-2]。 與其他谷物相比，藜麥氨基酸組成豐富，聯合國糧食及農業組織（FAO）推薦藜麥為可以滿足人體全部基本物質的完美營養食物[3]。藜麥不含麩質，升糖指數較低（GI 為35 左右），老人、小孩及高血糖、高血脂人群均可食用[4-6]。

藜麥的外殼中存在一種被稱為皂苷的糖苷化合物，皂苷味苦，食用前需要除去[7]。 傳統的皂苷去除方法是把藜麥浸泡在自來水中互相搓洗，但是這種方法耗水量大[8]。 而擠壓膨化作為一種熟化的處理方式，可以有效降低藜麥中的皂苷[9]，但也會對其中的酚類等生物活性物質造成破壞，會在擠壓膨化過程中由于高溫、 高壓和高剪切力的作用發生分解、脫羧以至于受到破壞，某些酚類物質和單寧類物質也會發生聚合， 導致相應的抗氧化能力下降。Zeng 等優化了擠壓過程中的變量[10]，如溫度、螺桿轉速、水分質量分數，目的是使擠壓產品獲得理想的口感和物理化學特性。耐高溫α-淀粉酶是一類催化α-1，4 糖苷鍵水解的淀粉水解酶，是現已廣泛應用于食品工程的酶。1980 年以來就有研究人員將耐高溫α-淀粉酶應用于擠壓膨化處理，目的是當擠壓機作為生物反應器時獲得更好的淀粉液化效果。2004 年Van 等通過在擠壓過程中添加耐高溫α-淀粉酶，發現加酶擠出樣品的流變學特性會因為酶的作用而發生變化[11]。Xu 等發現在糙米以及大米擠壓過程中添加耐高溫α-淀粉酶對總酚起到保護作用[12]。

由于藜麥在我國種植時間不長，并且其中的皂苷會對口感產生不利的影響，導致國內對藜麥產品精深加工較少。作者探討了添加耐高溫α-淀粉酶對擠壓膨化產物的理化性質以及酚類物質的影響，在擠壓膨化的過程中保護了藜麥中的活性物質。 而耐高溫α-淀粉酶與擠壓工藝耦合處理也是微生物發酵的一種很好的前處理方法，為后續藜麥的微生物發酵產品提供了途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色藜麥：安第優谷（廈門）商貿有限公司；高溫α-淀粉酶：諾維信（中國）投資有限公司；無水甲醇、福林酚、沒食子酸（GAE）等：上海源葉生物科技有限公司；碳酸鈉、鹽酸、醋酸鈉等：均為分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SLG30-IV 雙螺桿試驗機： 山東賽百諾機械有限公司；FW100 高速磨粉機： 天津泰斯特儀器有限公司；US1510 掃描電子顯微鏡： 捷克泰思肯儀器公司；Bettersize 2600 激光粒徑分析儀：丹東百特儀器公司；IS50 傅里葉紅外光譜儀： 賽默飛世爾科技公司；TechMaster2 快速黏度分析儀： 瑞典Perten 儀器公司；Epoch2 酶標儀： 美國Thermo 公司；1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀、 色譜柱HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 um）： 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備 利用高速磨粉機將藜麥進行破碎并過40 目篩得到藜麥粉。 用雙螺桿擠壓膨化機對藜麥粉進行處理， 擠壓參數參照張婷等的方法[13]并略作修改，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區擠壓溫度分別為70、90、110、140 ℃；調節水分至質量分數20%；螺桿轉速為25 Hz。膨化后的藜麥用高速磨粉機進行破碎，過60 目篩得到擠壓膨化的藜麥粉。 酶添加量參照Xu 等的方法[12]并略作修改，添加質量分數為0、0.05%、0.10%、0.30%、1.00%。 其中未處理樣品記為RAW、傳統擠壓樣品記為TE、酶聯擠壓處理樣品根據酶濃度記為EE-0.5、EE-1、EE-3、EE-10。

1.3.2 擠壓對吸水性、水溶性指數的影響 參照馮飛等的方法并稍作修改[14]，稱取1 g 樣品（W0）至恒重的離心管（W1）中，加入10 mL 蒸餾水，攪拌至樣品完全分散，置于30 ℃水浴保溫30 min，每10 min振蕩一次。 保溫結束后以3000 r/min 轉速離心15 min，將上清液倒入恒重的平面皿（W2）中，烘干稱質量（W3），將離心管和下層沉淀稱質量（W4）。 計算公式如下：

式中：IA為吸水性指數，%；IS為水溶性指數，%；W0為樣品質量，g；W1為離心管質量，g；W2為平面皿質量，g；W3為烘干后平面皿質量，g；W4為離心管和下層沉淀質量，g。

1.3.3 擠壓對微觀結構影響 參照肖悅等的方法并稍作修改[15]，采用掃描電子顯微鏡（SU1510）觀察藜麥樣品的微觀結構。 將樣品進行噴金處理，之后在40 kV 下進行觀察。

1.3.4 擠壓對粒徑的影響 參照Liu 等的方法并稍作修改[16]，使用激光粒徑分析儀（Bettersize 2600）測定，將樣品分散在攪拌池中，設定循環泵轉速為1600 r/min，遮光范圍10%～15%，檢測結果由儀器專用軟件對結果進行分析。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析 參照Blan 等的方法并略作修改[17]，使用傅里葉紅外光譜儀（IS50）進行測定，將1 mg 樣品與150 mg KBr 于研缽中研磨，充分研磨后置于紅外光譜儀，掃描范圍為4000 cm-1～500 cm-1，共掃描32 次，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 快速黏度分析 參照鄭排云的方法并稍作修改[18]，將3 g 樣品與25 mL 蒸餾水在鋁制罐中混合，待樣品完全分散后使用快速黏度分析儀進行測定。 儀器按照如下程序運行，50 ℃保持1 min，以恒速上升到95 ℃（3.8 min），保持2.5 min，再以恒速下降到50 ℃（3.8 min）， 保持1.4 min。 攪拌器在起始10 s 內轉速為960 r/min，之后保持在160 r/min。

1.3.7 擠壓對總酚、總黃酮質量分數以及抗氧化能力的影響 酚類提?。?參照Yu 等的方法并略作修改[19]，將0.2 g 樣品放置于10 mL 離心管中，加入5 mL 甲醇，在50 ℃下超聲提取90 min，將混合物在4 ℃以10000 r/min 離心10 min， 收集上清液作為游離酚提取液。 向殘留物中加入5 mL 的4 mol/L NaOH 溶液，30 ℃在220 r/min 搖床中水解4 h，將混合物在4 ℃以10000 r/min 離心10 min， 收集上清液于50 mL 離心管中， 用6 mol/L HCl 溶液將上清液的pH 調至1.5～2.0，并用10 mL 乙酸乙酯萃取結合的酚類化合物，萃取3 次。 將萃取液在35 ℃下旋轉蒸發干燥后，向燒瓶中加入5 mL 甲醇，超聲處理以溶解提取物，所得提取物為結合酚，與先前提取的游離酚混合后作為總酚提取物在-20 ℃儲存備用。

總酚質量分數的測定：參照李靜等的方法并略作修改[20]，取200 μL 酚類提取液加入200 μL 的0.25 mol/L 福林酚試劑，避光反應3 min，加400 μL質量分數15%Na2CO3溶液進行中和反應，25 ℃保溫30 min， 在760 nm 處測定吸光度， 并以沒食子酸（GAE） 制作標準曲線：y=12.949x+0.2671 （R2=0.993）。 樣品以每克干質量樣品中沒食子酸的質量分數表示。

總黃酮質量分數的測定：參照高秀印等并略作修改[21]，取200 μL 酚類提取液加入100 μL 的5 g/dL NaNO2溶液。反應6 min 后加100 μL 質量分數10%Al（NO3）3溶液。靜置6 min，加800 μL 質量分數4%NaOH 溶液，繼續靜置15 min，在510 nm 處測定吸光度， 并以蘆?。–E） 制作標準曲線：y=0.8725x+0.0528（R2=0.998）。 樣品以蘆丁質量分數計（mg/g）。

ABTS 自由基清除能力的測定： 參照Ti 等的方法并略作修改[22]，將7 mmol/L ABTS 溶液與2.45 mmol/L K2S2O2溶液以體積比1∶1 混合， 反應12～16 h，制成ABTS＋儲備液。使用前，用甲醇稀釋25 倍，使其在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將200 μL 酚類提取物與3 mL ABTS＋儲備液混合6 min， 在734 nm 處測定其吸光度， 并以水溶性維生素E 制作標準曲線，標準曲線為：y=-0.95x+0.678（R2=0.998）。結果以水溶性維生素E 質量摩爾濃度表示（μmol/kg）。

鐵氰化鉀法（FRAP）總還原能力的測定：參照Xu 等的方法并略作修改[12]，將300 mmol/L 乙酸鈉緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以體積比10∶1∶1 混合配制FRAP 工作液。取10 μL 酚類提取液， 加入1 mL 預熱過的FRAP工作液，37 ℃反應5 min，在593 nm 處測定吸光度。并以水溶性維生素E 制作標準曲線， 標準曲線如下：y=0.2531x+0.1026（R2=0.999）。結果以水溶性維生素E 質量摩爾濃度表示（μmol/kg）。

DPPH 自由基清除能力測定：參照Yu 等的方法并略作修改[23]，將0.25 mL 酚類提取物加入3.75 mL甲醇中， 然后加入1 mL 的0.2 mmol/L DPPH·至甲醇溶液中，避光反應30 min，在517 nm 處測定其吸光度，并以水溶性維生素E 制作標準曲線，標準曲線為：y=-0.4608x+0.6354（R2=0.998）。 結果以水溶性維生素E 質量摩爾濃度表示（μmol/kg）。

1.3.8 擠壓對酚酸含量的影響 總酚的提取參考Ge 等的方法[24]并略作改動，將10 g 樣品用甲醇超聲提取90 min 后離心取上清液，重復提取3 次，將提取液在45 ℃旋轉蒸發干燥后， 用水溶出并真空冷凍干燥得到酚類提取物。 將酚類提取物溶于色譜級甲醇并過0.22 μm 微孔膜。

HPLC 測定酚類化合物參考Cai 等的方法并略作改動，采用Apollo C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），流動相A 為體積分數1%冰乙酸，流動相B為色譜級無水甲醇[25]，洗脫程序：體積分數90% A和10% B（0 min）、65% A 和35% B（30 min）、50%A 和50% B （55 min）、40% A 和60% B （60 min）、90% A 和10% B（65 min）、90%A 和10%B（70 min），進樣量為10 μL，流量為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為280 nm。

1.4 數據處理

采用Origin 2018 以及SPSS 22 對實驗數據進行處理及統計分析， 顯著性差異水平為P＜0.05，所有實驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 擠壓對吸水性、水溶性指數的影響

吸水性指數（IA）和水溶性指數（IS）可以描述擠壓產品的分子損傷程度，是微生物發酵的關鍵[26]。由表1 可以發現，樣品的IA，經傳統擠壓后由2.02 上升至4.84，經加酶擠壓后隨酶濃度的增加從4.52 下降至3.19。 樣品的IS，經傳統擠壓后由0.13 下降至0.08，經加酶擠壓后隨酶濃度的增加從0.11 上升至0.29。 擠出物的IA反映了淀粉的持水能力，TE 的IA最高，這可能是由于淀粉在擠壓過程的高溫、高壓和高剪切力下， 降解為大量親水基團的糊精分子。隨著酶濃度的增加，EE 的IA降低。 證明酶促進了淀粉的水解，產生了更多的可溶性小分子物質。 TE 的IS降低約一半， 而隨著酶濃度增加，EE 的IS從0.11逐漸升高到0.29。 EE 的IS上升主要是因為樣品大分子物質降解為大量可溶性小分子物質。 并且這種IS升高的現象會影響擠出物的抗氧化性能， 因為樣品中一些美拉德產物（MRP）是由氨基酸與酶解產生的還原糖作用生成的， 而這些水溶性MRP 具有抗氧化性[27]。

表1 藜麥樣品吸水性和水溶性指數Table 1 Water-absorption and water-soluble index of quinoa samples

2.2 擠壓對微觀結構的影響

藜麥淀粉顆粒相較于其他來源的淀粉顆粒較小，當放大倍數為500 倍時，由圖1（a）可看出藜麥淀粉呈球形和橢圓形的團聚體，與文獻報道一致[28]。當放大倍數達到3000 倍后由圖可以清楚觀察到淀粉顆粒表面， 可觀察到RAW 樣品邊緣光滑具有完整的結構。 而擠壓處理后當放大倍數為500 倍時，由圖1（b）～（f）可以看出，淀粉顆粒以相對較大的顆粒結合在一起，放大3000 倍后，由圖1（h）可以看出TE 樣品表面有裂痕，EE 樣品形狀與TE 相似。擠壓過程中樣品的不同物質發生聚集，導致擠壓處理后樣品顆粒變大，由圖1（i）～（l）可以看出擠壓過程中在酶解作用下，淀粉發生水解導致顆粒表面有大量孔洞[26]，結構和形態發生了很大的改變，變得更為松散。

圖1 藜麥樣品的掃描電鏡圖Fig. 1 Scanning electron microscopy of quinoa samples

圖2 藜麥樣品的粒徑分布圖Fig. 2 Particle size distribution of quinoa samples

2.3 擠壓對粒徑的影響

由表2 可以發現，擠壓樣品其D10、D50、D90、D[4，3]都明顯高于RAW 樣品。 RAW 樣品有2 個峰，其中第一個峰主要對應于單個淀粉顆粒的存在，第二個峰主要對應淀粉、 蛋白質等物質組成的聚集顆粒的存在。 而擠壓處理后的樣品都只有一個峰，這是因為樣品經擠壓處理其蛋白質、淀粉等物質發生粘連。 雖然淀粉被酶水解成小分子， 但是在擠壓過程中還是發生了粘連，所以EE 樣品的D[4，3]、D10、D50、D90依然明顯高于RAW，與電鏡觀察得到的結論一致。

表2 藜麥樣品粒徑Table 2 Particle size of quinoa samples 單位：μm

2.4 傅里葉紅外光譜分析

FTIR 對短程分子水平上的結構變化很敏感，不同酶添加量的FTIR 光譜如圖3 所示。 RAW 的紅外光譜圖在3432 cm-1處觀察到單一強吸收峰， 對應淀粉分子中O—H 的伸縮振動。 分別在2926 cm-1和2855 cm-1附近觀察到不對稱的—CH 伸縮和對稱的-CH 伸縮。此外，羰基和H—O—H 伸縮分別在1743 cm-1和1654 cm-1附近清晰可見[27]。 然而TE和EE 的FTIR 光譜圖與RAW 基本相同。

圖3 藜麥樣品的傅里葉紅外光譜圖Fig. 3 Fourier infrared spectrum of quinoa samples

FTIR 光譜已被用于在分子水平上探索淀粉結構的短程有序性。 1022 cm-1和1045 cm-1的吸收帶分別與非結晶區和結晶區相關，所以可以用A1045/A1022來表示淀粉的短程有序程度[26]。RAW 樣品的比值最高，但經傳統擠壓后其比值下降，由0.85 下降到0.77。 這說明擠壓處理使得淀粉發生糊化，結構受到破壞，淀粉短程有序性下降。 而擠壓過程中酶的加入使得比值再次明顯下降，說明酶的加入使得淀粉發生水解，其結構發生更加劇烈的變化，與電鏡觀察得到的結論一致。

2.5 快速黏度分析

RVA 可以模擬樣品的蒸煮過程，是一種重要的分析樣品糊化特性的方法。 不同處理樣品RVA 黏度曲線見圖4。樣品經熱處理后的黏度均顯著降低。經TE 處理后的樣品峰值黏度由822 降低至288，經EE 處理后的樣品峰值黏度隨酶質量分數的提高逐步降低至32。 經TE 處理的樣品最終黏度由551 降低至331， 經EE 處理的樣品最終黏度隨酶質量分數的逐步提高降低至10。 樣品經TE 處理后黏度不僅下降，峰也發生前移，同時糊化溫度降低，這是因為擠壓處理過程中淀粉發生糊化，淀粉顆粒遭到破壞，一部分直鏈淀粉暴露，淀粉吸水膨脹能力減弱，進而使得黏度下降。 一部分大分子聚合物被分解成小分子物質，導致其吸水膨脹能力下降，也會導致黏度下降。 最終由于在擠壓處理過程中淀粉結構發生變化進而導致黏度降低[29]。EE 處理后黏度進一步下降，峰繼續發生前移，糊化溫度下降，這是因為高效的酶解作用加劇了淀粉的崩解，產生更多的小分子糊精[26]。 最終黏度的下降也說明酶解使得淀粉結構被破壞，與電鏡觀察到的結論一致。

圖4 快速黏度分析曲線變化圖Fig. 4 Rapid viscosity analysis curve

2.6 擠壓對總酚、總黃酮質量分數及抗氧化能力的影響

樣品總酚、 黃酮質量分數以及抗氧化能力（DPPH、ABTS、FRAP）的變化趨勢與Xu 等的研究結果相似[12]。 由表3 可以看出，樣品經TE 處理后多酚和黃酮質量分數分別由0.46%和1.58%降低至0.31%和1.07%；經EE 處理的樣品多酚以及黃酮質量分數隨酶濃度的升高而升高，至0.44%和1.45%，相較TE 處理的樣品多酚以及黃酮質量分數更高。由于擠壓是一個持續高溫高壓的狀態，雖然可以通過打破細胞壁的基質和多酚復合物中的共價鍵來提高酚類物質的可及性，但是一些不穩定的酚類化合物會發生脫羧反應并且分解，其他的一些生物活性物質也會被破壞，所以樣品的多酚以及黃酮質量分數有所下降[12]。 而EE 處理樣品的多酚以及黃酮質量分數隨酶濃度的提高而提高。 這是由于酶高效水解實現了淀粉的快速糊化與液化，使得原本惡劣的擠壓環境得到改善， 減小了機械沖擊和剪切力，因此酚類物質得到了保護[17]。

表3 總酚、總黃酮及抗氧化能力Table 3 Total phenols，total flavonoids contentand antioxidant activity

采用DPPH、ABTS 和FRAP 法測定樣品的抗氧化性， 由表3 可以看出，TE 處理的樣品比RAW 處理的樣品其抗氧化能力要低，這與其他膨化谷物得到的結果一致[12]。 這是由于惡劣的擠壓環境不僅使酚類物質受到損傷，還使得一些活性物質失活導致其抗氧化能力下降。 而相較于傳統擠壓，擠壓過程中酶的加入，不僅保護了酚類物質，而且還保護了其他活性物質免受機械能沖擊[17]。 而EE 處理的樣品的抗氧化能力隨酶濃度的升高而提高，最終超過RAW 的值， 這可能是由于擠壓過程中氨基和部分還原糖會發生反應產生一些MRP，而其中一些水溶性MRP 具有抗氧化性導致的[12]。

2.7 擠壓對酚酸質量分數影響

由表4 可知，樣品中的8 種酚酸類物質呈現的變化趨勢與總酚和黃酮質量分數測定的結果一致。對比不同的加工方式，TE 樣品的酚酸質量分數最低， 相較TE 處理，EE 處理樣品的酚酸質量分數有所提高， 在酶質量分數0.3%時，EE 處理使得阿魏酸、 蘆丁以及沒食子酸的保留量分別是TE 的200.8%、128.7%和443.7%。 雖然擠壓過程中對結構的改變可能會使結合的酚酸隨著細胞壁的破壞從細胞內釋放出來，轉化為游離形式，提高酚類物質的萃取性， 但是TE 樣品的酚酸質量分數依舊會下降。 這說明傳統擠壓環境不利于酚酸的保留，不穩定的酚類化合物在擠壓過程中會發生脫羧反應，而在擠壓過程中酶的加入使得酚類物質得到了保護。這是因為酶的高效水解性，液化了擠壓環境，但是擠壓還是會使得除沒食子酸和咖啡酸之外其他酚酸的質量分數下降， 這點與總酚測定的結果相同，而EE 樣品中沒食子酸、 咖啡酸質量分數高于未處理樣品。 這是因為在酶的作用下酚-葡萄糖苷（共軛酚）中可能釋放出酚酸[10]，會導致酚酸質量分數上升。

表4 藜麥樣品中酚酸質量分數Table 4 Phenolic acid mass concentration in quinoa samples

3 結語

通過對藜麥不同處理組理化性質的測定分析，發現傳統擠壓會使藜麥中淀粉發生糊化和降解，結構發生破壞，導致其水溶性指數下降、吸水性指數上升、黏度下降、粒徑變大、抗氧化性減弱，而酶促擠壓處理的樣品相較傳統擠壓處理的樣品水溶性指數上升、吸水性指數下降、黏度下降、粒徑變小、抗氧化性提高。 作者通過對其酚酸質量分數的測定發現，藜麥經傳統擠壓工藝后酚酸質量分數明顯下降，而加酶擠壓之后，由于酶的高效水解性能，其樣品中淀粉實現了快速液化，從而改善了惡劣的擠壓環境，使得酶促擠壓中酚酸得到保護，質量分數有所提高。