旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺的研制

孔振翔， 姚延祿， 周新麗

（上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093）

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）作為普遍使用的核酸檢測技術之一，具有檢測成本低、操作簡單、高特異性和靈敏度的優點[1-2]。 但是，該方法耗時長且容易產生假陽性結果[3]。 微流控芯片技術可以將核酸提取、擴增、檢測等功能集成到一片數平方厘米的芯片中[4-5]，具有微型化、集成化、高通量、自動化等優勢[6]。 微流控PCR 儀將微流控芯片技術與PCR 技術相結合[7]，把檢測過程中的核酸提取、試劑的預存儲以及后續的擴增與熒光檢測環節集成在一臺儀器中，可以減少試劑消耗，提高熱循環速度，提高檢測儀器的自動化程度，顯著提升檢測效率[8-10]，解決核酸擴增領域中存在氣溶膠污染的問題[11]。

目前， 微流控PCR 儀的研制也存在兩大難點：一是將核酸提取、擴增、檢測的功能全部集成在一張芯片上；二是微流控芯片專用PCR 儀所需3 個溫度的快速、精準控制。

在擴增平臺的一體化、 自動化方面，BioFire 公司的FilmArray 產品使用柔性袋進行核酸提取，使用巢式多重PCR 技術進行核酸擴增，同時搭配熒光檢測， 在相同的血液樣本中可一次檢測出24 種不同的病原體[12]。 Cepheid 公司研發的GeneXpert 分子診斷試劑盒和配套使用的全自動測試儀器，采用半導體制冷片對PCR 反應管的上下兩側進行溫度控制，搭配風扇散熱，通過熒光組件實時測算PCR 的循環狀態[13]。 以上2 種自動化核酸檢測儀器均集成了核酸提取、核酸擴增及熒光檢測全過程，但這些過程并不都在微流控芯片上完成， 還借助了柔性袋、試劑盒等，且核酸提取和溫度控制部分的硬件控制都很復雜，儀器制造成本較高。

在擴增平臺的溫度控制上，根據微流控芯片中液體加熱方式的不同，可以分為靜態微池PCR[14]和連續流動PCR[15]。 李松晶等通過溫控單元對溶液加熱，使芯片不同區域之間產生溫差，利用溫差所產生的熱對流來推動溶液循環流動[16]。但是，此方法需使用冷卻液對溶液降溫，降溫速率不可控，且隨著PCR 擴增反應的進行，冷卻液溫度逐漸回升，進而會影響降溫速率。Jung 等設計了一種旋轉PCR 分析儀，該平臺使用步進電機帶動芯片依次通過3 個加熱塊，完成基因擴增僅需25.5 min[17]。 但是此平臺只有PCR 擴增功能，未集成核酸提取以及檢測功能。

從以上分析可以看出，要實現核酸提取、擴增與檢測集成，目前仍有一些關鍵問題需要解決。 作者設計并搭建了一套旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺，在步進電機低轉速條件下使用微流控芯片可完成基于磁珠法的核酸提取，之后直接利用此旋轉式三溫區擴增平臺完成擴增步驟， 實現核酸提取、擴增一體化。首先，作者對三溫區PCR 擴增平臺各模塊進行功能分析以及機械結構設計，然后對各模塊進行裝配并進行溫度測試，最后使用核酸提取芯片對大腸桿菌進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳評估擴增效果。 本研究結果將為實現核酸提取、擴增一體化的微流控PCR 設備的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

光學級聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）板材：恒心亞克力制品有限公司；聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）膠帶：晨光塑業有限公司；光學級雙面膠：深圳泰贏科技有限公司。

Trans 1k Plus Ⅱ Molecular Marker、10 ×loading buffer、Easy Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、10×EasyTaq buffer（含Mg2+）、dNTPs（2.5 mmol/mL）：北京天根生化科技有限公司。

大腸桿菌（ATCC43895）：中國檢驗檢疫科學研究院動植物檢疫所。

二氧化碳激光雕刻機 （VLS2.30）： 美國UNIVERSAL；超聲波清洗機（YQ-620C）：上海易凈超聲波儀器有限公司；芯片貼合機（TBK508）：深圳市深旺達科技有限公司；核酸提取儀：西安天隆科技有限公司；9700 型PCR 儀： 美國Applied Bio systems 公司； 超純水儀： 美國PALL 公司；Mini Protean Ⅲ型電泳槽、PowerPac300 多用電泳儀：美國Bio-Rad 公司；凝膠成像儀：美國UVI 公司；ST16 低溫離心機：北京賽默飛科技有限公司。

1.2 芯片的設計與制作

芯片由4 層厚度分別為0.3、2.0、1.0、0.3 mm 的PMMA 板材組成[18]，第一層為蓋板層，包括進樣孔以及抽樣孔，進樣孔是將裂解混合液進入微流控芯片的孔，抽樣孔是將核酸洗脫液抽出進行質量濃度測定；第二層為腔室層，主要包括裂解腔、清洗腔1～4、擴增腔，用于試劑存儲以及將各腔室隔離，位于通道層之內，各腔室的體積分別為163、180、100、180、60、50 μL[19]；第三層為通道層，通道層與腔室層厚度差為1 mm， 利用此厚度差使得磁珠在各腔室之間轉移，完成清洗以及洗脫步驟；第四層為底板層，主要用于密封鍵合芯片，其結構見圖1。

微流控芯片的制作采用二氧化碳激光雕刻法。首先使用SolidWorks 軟件設計出微流控芯片的三維結構，通過結構分割將芯片劃分為4 層，包括蓋板層、腔室層、通道層及底板層，并使用CAD 軟件繪制各層圖案。 然后，將繪制好的各層幾何圖案通過數據傳輸傳送至二氧化碳激光雕刻機進行平面雕刻，雕刻參數為：功率80 W，速度20 s，PPI 1000，得到各通道層基片。 然后，將雕刻好的各層PMMA基片放入含有去離子水的超聲清洗機中清洗15 min 并放入烘箱中烘10 min， 再將各層使用光學級雙面膠并置于真空貼合機中鍵合， 鍵合參數設置為：真空度100 kPa、鍵合壓力4.2 kg/cm2、鍵合時間10 min。最后將鍵合后的芯片放入除泡室中，設置除泡壓力7.5 kg/cm2、除泡10 min，即獲得最終芯片。

1.3 旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺的搭建

旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺，采用空間上溫度循環代替時間上溫度循環的設計思路，其整體結構見圖2。根據擴增系統的功能需求，分為溫度控制模塊和旋轉循環模塊。 溫度控制模塊包括陶瓷加熱片和比例-積分-微分 （proportion- integralderivative，PID）恒溫控制器。 旋轉循環模塊包括轉軸、步進電機和驅動控制器。

圖2 旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺示意圖Fig. 2Schematic diagram of the rotary three -temperaturezonemicrofluidicPCR amplification platform

1.3.1 溫度控制模塊 采用熱均勻性良好的陶瓷加熱片作為加熱元件，樹莓派開發板作為中央控制器，通過PID 恒溫控制器XH-W1419 來控制陶瓷加熱片。 在實際操作中，中央控制器先將設定的溫度值發送給恒溫控制器，之后以1 Hz 的頻率讀取溫度傳感器的溫度值，當接近設定值時，則緩慢改變電壓來維持溫度的穩定，同時將計算出的溫度值通過串口傳遞給中央處理器。 中央處理器在接收到返回的溫度值后刷新屏幕，實現溫度的控制與實時顯示。

1.3.2 旋轉循環模塊 采用發熱低的日本山社57步進電機控制微流控芯片的旋轉角度，即控制芯片在不同溫度的加熱片上做周期性旋轉，從而完成核酸擴增過程中的變性、退火、延伸。 同時，為了承載陶瓷加熱片、PID 恒溫控制器、步進電機、電機驅動器以及驅動控制器，設計一個旋轉循環轉臺來放置這些配件。 轉臺整體采用不銹鋼材料，且厚重的底板可以保證電機在高速運動的狀況下不會出現位移和抖動。 轉軸的作用是連接芯片與電機，實現電機動力的傳輸。 整個擴增平臺的運行流程見圖3。

圖3 旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺流程圖Fig. 3 Flow chart of rotary three -temperature zone microfluidic PCR amplification platform

1.4 旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺的性能測試

1.4.1 陶瓷加熱片的性能 為了保證加熱模塊的溫控性能，對陶瓷加熱片表面的溫度進行均勻性和穩定性測試。 通過PID 溫度控制器對3 個加熱片設置3 個不同溫度（95、55、72 ℃），并在陶瓷加熱片的中心和對角線位置處放置3 個熱電偶（a，b，c），用安捷倫34970A 數據采集儀對加熱片表面溫度進行數據采集。

1.4.2 升降溫速率 在旋轉式三溫區微流控PCR擴增平臺上，待加熱片加熱至預設溫度后，將插有熱電偶探頭的微流控芯片放至離心轉臺。 當反應腔室轉至加熱片上方時，記錄下此刻的時間和芯片內部溶液的溫度， 待芯片內溶液加熱至目標溫度后，再次記錄此刻的時間和芯片溶液內部的溫度，即可得到升溫速率。 然后轉動微流控芯片90°至另一加熱片之上，繼續記錄相對應的時間和溫度，得到降溫速率。

1.5 芯片上大腸桿菌的核酸擴增

將大腸桿菌加載到微流控芯片中，按照姚延祿的方法[18]，通過磁珠法在微流控芯片中提取核酸，提取到的核酸保存在擴增腔中。 在搭建的旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺上，提前對3 個加熱片進行預熱。 然后，將芯片上轉動至第一塊加熱片上方，芯片內溶液加熱到95 ℃維持30 s， 完成高溫變性反應；再將芯片轉動90°，到達第二塊加熱片上方，芯片內溶液加熱到55 ℃維持30 s， 完成低溫退火反應；繼續轉動芯片90°，使反應區到達第三塊加熱片上方，芯片內溶液加熱到72 ℃維持20 s，完成延伸反應。至此，完成一輪PCR 反應，如圖4 所示。隨后，使芯片繼續沿同方向轉動180°， 回到初始位置，按照上述過程，使芯片循環旋轉35 次。

圖4 核酸擴增過程示意圖Fig. 4 Schematic diagram of nucleic acid amplification process

在9700 型PCR 儀上，設置擴增程序為：在95 ℃下初始變性5 min，95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s 和72 ℃下延伸20 s 進行35 次循環， 最后在72 ℃下進行10 min 的最終延伸。

擴增反應結束后， 取9700 型PCR 儀和微流控芯片中的擴增產物各25 μL， 在1 g/dL 瓊脂糖凝膠上使用120 V 電壓電泳30 min，用0.5 mg/L 的溴化乙啶（EB）染色，然后將凝膠置于凝膠成像儀上，在紫外燈照射下觀察并拍攝。

2 結果與分析

2.1 陶瓷加熱片的性能

通過在陶瓷加熱片的不同位置處放置熱電偶對其進行均勻性和穩定性的測試，可以發現各個加熱片上不同測溫點的溫度曲線近乎重合， 溫度在0.1 ℃的范圍內波動， 且每個測溫點的誤差均在±0.3 ℃的范圍內，如圖5 所示。 由此可見，該加熱片上不同位置的溫度波動不大，具有良好的溫度均勻性和溫度穩定性。

圖5 陶瓷加熱片的溫度均勻性和溫度穩定性測試Fig. 5 Temperature uniformity and stability of ceramic heaters

2.2 升降溫速率

對芯片腔室內溶液的溫度進行采集，結果見圖6。隨著步進電機的轉動，芯片腔室內溶液的溫度也隨之變化， 且芯片腔室內溶液的升溫速率為3.5 ℃/s，降溫速率為2.67 ℃/s，完成1 個PCR 溫度循環的時間為110 s。 相較于9700 型PCR 儀，升溫速率提升了約36.19%， 降溫速率提升了約24.77%， 單次PCR溫度循環縮減了70 s，對于整個PCR 擴增過程來說（35 次循環），至少可以節約40 min，提高核酸擴增的效率。

圖6 芯片內部溶液的升降溫曲線Fig. 6 Heating and cooling curve of the solution inside the chip

2.3 大腸桿菌核酸擴增的結果

使用旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺與9700 型PCR 儀同時進行PCR 擴增， 擴增后的電泳結果見圖7。 左側為9700 型PCR 儀擴增結果，右側為旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺的擴增結果，且左右兩側5 個重復實驗的結果均在369 bp 左右出現條帶，二者亮度基本一致，說明旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺的擴增效果和重復性與9700型PCR 儀基本相同。

圖7 大腸桿菌擴增產物電泳圖Fig. 7 Electropherogram of E. coli

Salman 等提出一種并列式的微流控PCR 擴增平臺，該平臺搭載3 個加熱片，通過電機的旋轉將微流控芯片加載到相應的加熱片上，實現核酸擴增[20]。但是， 該平臺升溫速率和降溫速率分別為1.8 ℃/s和2 ℃/s，導致整個核酸擴增的循環時間有所延長。

將9700 型PCR 儀、 單溫區半導體制冷片微流控芯片、Salman 等搭建的三溫區PCR 擴增平臺與本研究所搭建的旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺進行對比分析，如表1 所示。 相較于Salman 等搭建的三溫區PCR 擴增平臺，作者搭建的旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺在升降溫速率上更快，尤其在升溫速率上，提升了將近2 倍。 與其他2 款采用單溫區的PCR 擴增平臺相比，作者搭建的擴增平臺采用三溫區分別對微流控芯片內部的溶液進行加熱，避免在單個溫控片上進行升降溫操作，提高升降溫速率的同時也縮短了循環時間，并且溫度控制也更加容易。

表1 PCR 擴增平臺性能對比Table 1 Comparison of PCR amplification performance

3 結語

微流控芯片與PCR 技術相結合雖然取得了很大進展，但在微流控芯片的集成度和溫度的控制上仍存在一定的問題。 為此， 作者在微流控芯片與PCR 技術的基礎上，采用空間上溫度循環代替時間上溫度循環的設計思路，搭建了一套旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺，測量陶瓷加熱片上不同區域的溫度和單點溫度隨時間的變化，結果表明陶瓷加熱片不同區域之間的溫差在0.1 ℃范圍內， 單點的熱穩定性在±0.3 ℃范圍內，具有較好的熱均勻性和熱穩定性。 與其他3 款擴增平臺相比，本平臺的升降溫速率有著較大的提升，能夠縮減PCR 擴增的時間，提高工作效率。 對大腸桿菌的擴增產物進行電泳分析， 可以發現本平臺的電泳條帶亮度與9700型PCR 儀基本一致，但在擴增時間上有著較大的提升，僅需110 s 即可完成單次循環，在一個完整的擴增周期內可以節約40 min 左右的時間。旋轉式三溫區微流控PCR 擴增平臺在保證熱均勻性和熱穩定性的情況下，簡化了溫控結構、提升了升降溫速率、縮短了循環時間。 未來的研究可以嘗試將核酸檢測的功能集成到該平臺上，在微流控芯片上實現核酸提取、擴增、檢測的功能，實現平臺的一體化、自動化。