喜樹果黃酮綠色提取工藝的響應面法優化

張欣欣,范圓圓,原甜夢,劉雨露,肖 莉

(湖州師范學院 生命科學學院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

喜樹果(FructusCamptothecaeAcuminatae)為藥用植物喜樹的果實,含喜樹堿類、黃酮類、鞣花酸類等成分,具有抗癌、散結、破血化瘀等功效[1].目前,對于喜樹果的研究主要集中于喜樹堿類抗癌成分[2],而對于黃酮類成分的研究鮮有報道.黃酮化合物具有抗氧化、抗心腦血管疾病、延緩衰老等多種生理功能,因此具有較高的臨床應用價值.由于黃酮類成分水溶性較差,傳統提取方法大多采用乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有機溶劑[3].但傳統提取方法存在成本高、環境污染大,以及提取物有機溶劑殘留超標等缺陷.因此,尋找高效環保的綠色溶劑成為當務之急.

低共熔溶劑(DES)是由氫鍵供體與氫鍵受體合成的混合溶劑,在特定比例下二者之間會產生較強的分子間氫鍵作用,對一些難溶性物質有特殊的溶解性能,具有綠色、環保、提取效果優良等有機溶劑無法比擬的優點,目前已被廣泛應用于中藥材的提取和分離方面,具有較好的市場應用前景[4-6].

本研究以喜樹果總黃酮(FructusCamptothecaeAcuminataeflavonoids,FCAFs)提取率為指標,采用超聲波輔助DSE溶劑法和Box-Behnken響應面設計方法建立模型,從而得到最優的提取工藝,實現FCAFs的綠色高效提取,以更好地促進喜樹果的深度開發.

1 實 驗

1.1 材料與儀器

喜樹果,購自慕韓齋藥店,過40目篩粉碎備用;蘆丁標準品、氯化膽堿、葡萄糖、乙二醇、乳酸、1,2-丙二醇、甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丙二酸、檸檬酸、蘋果酸、尿素,均為分析純,購自上海麥克林生化科技有限公司.

ES-600型電子分析天平(湖南湘平科技公司)、KQ2200DE型超聲清洗器(武漢集思儀器設備公司)、UV2600紫外-可見分光光度計(日本島津公司)、GL-20G-Ⅱ高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)、HHS數顯水浴鍋(河南長征科貿公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮提取率的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定FCAFs含量[7],得到標準曲線方程：Y=0.008 3X+0.014 1,R2=0.999 9.當總黃酮濃度在0.005～0.035 mg/mL 范圍內時,其線性關系良好.

按式(1)計算FCAFs提取率：

(1)

其中,W為FCAFs提取率(%),X為提取液中FCAFs質量濃度(mg/mL),V為提取液體積(mL),M為喜樹果粉末質量(g).

1.2.2 DES的合成

以氯化膽堿為氫鍵受體,選擇乙二醇、乳酸、1,2丙二醇、甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、檸檬酸、蘋果酸、丙二酸、尿素、葡萄糖12種物質為氫鍵供體,制備12種DES溶劑,分別為：氯化膽堿∶乙二醇摩爾比為1∶4(組1);氯化膽堿∶乳酸(摩爾比)為1∶1(組2);氯化膽堿∶1,2-丙二醇(摩爾比)為1∶1(組3);氯化膽堿∶甲醇(摩爾比)為1∶1(組4);氯化膽堿∶乙醇(摩爾比)為1∶1.5(組5);氯化膽堿∶1,3-丁二醇(摩爾比)為1∶3(組6);氯化膽堿∶1,4-丁二醇(摩爾比)為1∶3(組7);氯化膽堿∶檸檬酸(摩爾比)為1∶1.5(組8);氯化膽堿∶蘋果酸(摩爾比)為1∶3(組9);氯化膽堿∶丙二酸(摩爾比)為1∶3(組10);氯化膽堿∶尿素(摩爾比)為1∶1(組11);氯化膽堿∶葡萄糖(摩爾比)為1∶3(組12).將上述12種DES溶劑的含水量均控制在20%,在加熱條件下磁力攪拌直至形成均相溶液,冷卻至室溫備用.

1.2.3 FCAFs的提取

精密稱取12份0.5 g喜樹果粉末,按照一定液料比分別加入到1.2.2中合成的12種DES溶劑中,40 ℃超聲(200 W,35 kHz)提取60 min,提取液離心15 min(5 000 r/min),取上清液并按1.2.1中的方法計算FCAFs提取率.

1.2.4 單因素試驗

以FCAFs提取率為指標,選擇5個因素進行單因素考察,分別為：加水量(水平設置為0%、20%、40%、60%、80%)、DES(氯化膽堿∶檸檬酸)摩爾比(水平設置為2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、2∶5)、液料比(水平設置為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1)(mL/g)、提取溫度(水平設置為20、30、40、50、60 ℃)、提取時間(水平設置為20、30、40、50、60 min).

1.2.5 響應面優化試驗

參考單因素試驗結論,選擇對黃酮提取效果影響較大的3個因素,即液料比、提取時間、提取溫度為自變量,FCAFs(R1)為響應值,利用 Box-Behnken響應面優化法設計3因素3水平優化試驗.具體因素與水平見表1.

表1 響應面因素水平表

2 結果與分析

2.1 DES溶劑篩選

圖1為DES 溶劑的篩選情況.由圖1可知,第8組的FCAFs提取率最高,為2.85%,故選擇氯化膽堿與檸檬酸合成的DES溶劑為提取溶劑.

圖1 DES 溶劑的篩選

2.2 單因素試驗

2.2.1 DES摩爾比對FCAFs提取率的影響

圖2為DES摩爾比對FCAFs提取率的影響.由圖2可知,當氯化膽堿∶檸檬酸的摩爾比從1∶0.5到1∶2.5變化時,FCAFs提取率呈先升后降的趨勢.其主要原因是氯化膽堿的極性較低,檸檬酸的極性較高,當它們的摩爾比達到1∶1.5時,最適極性剛好形成,此時FCAFs提取率最高,達2.85%.

圖2 DES摩爾比對FCAFs提取率的影響

2.2.2 含水量對FCAFs提取率的影響

圖3為含水量對FCAFs提取率的影響.由圖3可知,FCAFs提取率隨DES體系含水量的提高而升高,當含水量為20%時,達到最高值2.48%.其原因可能是初期水的加入降低了溶劑體系的粘度,有助于提高喜樹果藥材中細胞破壁的能力,從而提升黃酮的溶出率.但當體系含水量進一步提高時,在體系粘度降低的同時溶劑極性增加,使分子間的氫鍵和超分子結構遭到破壞,進而使FCAFs提取率下降[8].

圖3 含水量對FCAFs提取率的影響

2.2.3 液料比對FCAFs提取率的影響

圖4為液料比對總黃酮提取率的影響.由圖4可知,FCAFs提取率隨液料比的增大而升高,當液料比達到60∶1 時,FCAFs提取率達到峰值2.89%.其原因可能是初期液料比的增大有利于喜樹果藥材細胞破壁,使黃酮溶出率增大.但液料比的進一步增加可能會引起黃酮溶解出現過飽和,進而使FCAFs提取率下降.

圖4 液料比對FCAFs提取率的影響

2.2.4 超聲溫度對FCAFs提取率的影響

圖5為溫度對FCAFs提取率的影響.由圖5可知,在50 ℃前,FCAFs提取率隨超聲溫度的升高而升高,但繼續升高溫度,總黃酮提取率下降.其原因可能是升溫導致DES體系的黏度下降,增加了喜樹果粉末的分散性,加速了溶質的傳質作用,有利于有效成分的析出.但當體系溫度進一步升高時,黃酮類化合物會發生降解反應,導致FCAFs提取率下降[9].

圖5 溫度對FCAFs提取率的影響

2.2.5 提取時間對FCAFs提取率的影響

圖6為提取時間對FCAFs提取率的影響.由圖6可知,FCAFs提取率隨提取時間的延長而升高,50 min時達到峰值3.18%,隨后提取率開始下降.其原因可能是隨著提取時間的延長,超聲波引起的空化效應逐步增強,導致對喜樹果細胞壁的破壞力度加大,FCAFs提取率提高.但超聲時間的延長也會引起體系溫度上升、超聲輻射和熱效應作用增強,以及黃酮類成分的降解,從而使FCAFs提取率下降.

圖6 提取時間對FCAFs提取率的影響

2.3 響應面試驗結果與優化

基于單因素試驗結果,選擇液料比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)3個因素為自變量,以FCAFs提取率為響應值(R1),按照Box-Behnken優化法設計17組實驗.實驗設計及結果見表2.

表2 Box-Behnken 實驗設計及結果

以FCAFs的提取率為指標(R1),采用Design-expert軟件進行線性回歸擬合,得到回歸方程：R1=3.27-0.033A+0.070B+0.005C-0.015AB-0.045AC-0.005BC-0.17A2-0.27B2-0.26C2.回歸模型方差分析見表3.

表3 回歸模型方差分析

圖7 兩因素交互作用對FCAFs提取率影響的響應面圖

2.4 最優方案驗證

通過Design-Expert軟件分析得到FCAFs的最優提取工藝為：含水量為20%、液料比為60.9∶1(g/mL)、50 ℃提取1次、提取時間為51.3 min.結合實際的實驗條件及操作的可行性,修正的最優方案為：含水量為20%、液料比為61∶1(g/mL)、50 ℃超聲提取1次、提取時間為51 min.修正的最優方案的FCAFs提取率理論值為3.28%.按此工藝進行3次平行實驗,FCAFs平均提取率為3.29%,接近理論值,說明該優化工藝穩定可靠.

3 結 論

本文采用超聲波輔助DES溶劑法,建立并優化了一種綠色高效的喜樹果黃酮提取工藝.以FCAFs提取率為指標,通過單因素試驗考察DES溶劑組成(氯化膽堿與檸檬酸的摩爾比、含水量)、液料比、提取時間、提取溫度等因素對FCAFs提取率的影響,并在此基礎上結合Box-Behnken響應面法分析得到最優的提取工藝：氯化膽堿與檸檬酸的摩爾比為 1∶1.5、加水量為20%、液料比為61∶1(g/mL)、50 ℃超聲1次、超聲時間為51 min.在此條件下,FCAFs提取率約為3.29%,是文獻報道的有機溶劑提取率[10]的3倍.本研究為喜樹果的開發利用提供了參考,也為中藥材活性成分的綠色提取提供了一定的借鑒.