異戊酸血癥患兒臨床特征、基因型及隨訪分析

孫宇寧 梁黎黎 丁 思 劉宇超 陳 婷 龔珠文 邱文娟 張惠文 顧學范 韓連書

上海交通大學醫學院附屬新華醫院 上海市兒科醫學研究所 兒內分泌遺傳科（上海 200092）

異戊酸血癥（isovaleric acidemia，IVA，OMIM 243500）是亮氨酸分解過程中的代謝產物異戊酰輔酶A脫氫酶（isovaleryl‐CoA dehydrogrnase，IVD）缺陷，導致旁路代謝生成的異戊酸、異戊酰甘氨酸和3‐羥基異戊酸及異戊酰肉堿（isovalerylcarnitine，C5）在體內蓄積，可產生特殊“旱腳味”（主要由未結合異戊酸所致），導致急性酸中毒或多種臟器功能損傷的疾病[1]。發病率在不同國家差異較大，德國約為1/62500[2]，美國約為1/250000[3]。我國各地區發病率差異較大，我國臺灣約為1/365000[4]，浙江省約為1/234000[5]，福建泉州地區的發病率為1/84469[6]。根據本院782 萬新生兒串聯質譜篩查數據，推測我國IVA的發病率為1/195492[7]。IVA為IVD基因變異所導致的常染色體隱性遺傳病，IVD基因位于染色體15 q 14‐15，包括12 個外顯子，長15 kb，編碼394個氨基酸。IVA臨床表現缺乏特異性，根據發病時間及臨床表現，主要分為急性新生兒型、慢性間歇型和無癥狀型[8]。急性新生兒型患兒如不能得到及時的診斷和治療，發病后致死致殘率極高。IVA主要通過血C5、C5與乙酰肉堿（acetylcanitine，C2）比值（C5/C 2）、C 5 與丙酰肉堿（propionylcarnitine，C 3）比值（C 5/C 3）及尿異戊酰甘氨酸或3‐羥基異戊酸增高做出診斷，基因變異分析可明確基因變異類型[9]。本研究通過總結34例IVA患兒的臨床資料及基因變異分析，為臨床醫師提高對該病的早期識別和診斷提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇 2012年4月至2023年10月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院兒內分泌遺傳科明確診斷（或外院診斷復核明確），并進行治療和隨訪的IVA患兒作為研究對象。納入標準：①年齡0 天～4 歲8個月；②符合IVA 診斷標準[10]；③有臨床發病情況記錄。排除標準：基因檢測結果已經排除IVA 的患兒或確診為其他遺傳代謝病的患兒。

本研究經上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會審查批準（NO.XHEC‐D‐2023‐220）。所有檢查獲得患兒家長或監護人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 IVA 診斷標準 IVA 診斷依據為滿足下述3 個條件中2 條：①血C 5 ＞0.40 μmol/L、C 5/C 2、C5/C3比值升高；②尿有機酸分析提示異戊酰甘氨酸＞2.0mmol/mol肌酐，或者伴有3‐羥基異戊酸增高；③IVD基因檢出復合雜合或純合致病或可能致病變異[11]。

1.2.2 臨床資料收集 包括患兒性別、起病年齡、起病癥狀及新生兒篩查情況，一般實驗室檢驗包括血常規、血氣、乳酸、肝功能、血氨、電解質、血糖，血液中C5、C3、C2水平，C5/C2比值及C5/C3比值，尿中異戊酰甘氨酸水平，頭顱核磁共振成像（MRI）結果以及基因檢測結果。

1.2.3 血?；鈮A和尿有機酸檢測 采用串聯質譜技術檢測患兒血中C 5、C 3 及C 2 水平，并計算C 5/C 2 及C 5/C 3 比值。標本采集用干血濾紙片法，檢測方法參考文獻[12]。串聯質譜儀為美國生物應用系統公司產品（API 2000/API 4000型）。采用氣相色譜質譜技術檢測尿異戊酰甘氨酸及3‐羥基異戊酸，檢測方法參考文獻[13]，氣相色譜質儀為日本島津公司產品（QP2010型）。

1.2.4 基因檢測 應用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管提取患兒及其父母外周靜脈血各2 mL 進行Sanger 測序或全外顯子組測序。具體方法[14]：采用全基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國）提取DNA，用Covaris S220超聲破碎儀（Covaries公司，美國）將基因組DNA片段剪切為200 bp左右片段，用全外顯子捕獲試劑盒（IDT公司，美國）進行捕獲，用Illumina NovaSeq 6000測序儀（Illumina公司，美國）對捕獲片段進行雙端測序，測序片段長度為150 bp。測序產生的fastq數據用BWA比對到hg19參考基因組，獲得的可疑變異通過查閱本地人群數據庫、千人基因組（1000 G）和人群基因組變異頻率數據庫（gnomAD）以及疾病數據庫（HGMD）進行分析；根據最新美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）指南對變異位點的致病性進行分析[15]。明確基因變異患兒的父母進一步進行 Sanger測序，以明確致病變異來源。

1.2.5 隨訪 隨訪截至2023年12月。每3～6個月門診隨訪1 次，對無法按時門診隨訪的患兒予以電話隨訪患兒的預后包括治療情況，有無疾病急性發作，智力發育水平，常規生化檢測包括血常規、肝功能、電解質、血氣和血糖等檢測結果，血串聯質譜和尿氣相質譜等復查結果。＜6歲患兒采用Gesell（0～6歲）發育量表評估患兒智力發育水平，結果用發育商數（DQ）表示。75 ＜DQ ＜85 為邊緣水平，55≤DQ≤75為輕度發育遲緩，40≤DQ＜55為中度發育遲緩，25≤DQ＜40為重度發育遲緩，DQ＜25為極重度發育遲緩；對無法進行上述量表評估的患兒，由有經驗的臨床醫生評估其語言、運動、認知功能及行神經系統查體。

1.3 統計學分析

采用 SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。非正態分布計量資料以中位數（P25～P75）或中位數（全距）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

共納入35例IVA患兒，排除1例（新生兒篩查陽性，隨訪后血串聯質譜正常，并通過基因診斷排除）。最后納入分析34例，男22例、女12例，男女比例1.8:1，患兒父母均非近親婚配。其中15例為急性新生兒型，中位發病年齡為3d（范圍2～9 d），死亡4例；3例為慢性間歇型，中位發病年齡24月（范圍6～56月）；余16例均為新生兒篩查確診的無癥狀型患兒。急性新生兒型IVA患兒首發臨床表現為精神反應差（12例）、喂養困難（8例）、嘔吐（5例）、皮膚可聞及特殊氣味（2例）、低體溫（1例）；慢性間歇型均為嘔吐起?。?/3），1例尿液聞及“旱腳味”。

2.2 常規實驗室檢測結果

急性新生兒型IVA患兒發病時三系下降5例，代謝性酸中毒7例，血氨升高7例，肝功能異常6例，肌酸激酶升高2例，低血鈣2例，低血糖2例。慢性間歇型3例患兒發病時均有代謝性酸中毒。

2.3 血串聯質譜及尿氣相色譜質譜檢測結果

34 例IVA 患兒治療前檢測結果見表1。根據有無臨床表現，將IVA患兒分為有臨床癥狀組（n=18）[包括急性新生兒型（n=15）、慢性間歇型（n=3）]及無癥狀型組（n=16）。與無癥狀型組相比，有臨床癥狀組血中C 5 水平，C 5/C 2 比值及C 5/C 3 比值以及尿中異戊酰甘氨酸水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 IVA患兒血串聯質譜及尿氣相色譜質譜治療前檢測結果[M(P25～P75)]

急性新生兒型患兒中共4 例死亡，均屬新生兒期起病，為發病或死亡后確診，未行新生兒篩查。4例IVA死亡患兒血中C5、C5/C2比值、C5/C3比值以及尿中異戊酰甘氨酸水平均顯著升高，分別為9.85（7.02～16.20）μmol/L、0.54（0.45～1.04）、12.01（10.97～33.95）、979.88（969.96～989.80）mmol/mol肌酐。

2.4 頭顱磁共振成像檢查

6 例患兒行頭顱MRI 檢查，4 例出現異常改變，2 例未見明顯異常。其中3 例為急性新生兒期型，1例為無癥狀型。受累部位無明顯特異性：1例為基底節多發異常信號，1 例腦白質容積偏小，1 例雙側大腦腳及內囊受累，呈對稱性斑片狀改變，1例兩側腦室三角區異常信號。

2.5 基因變異檢測結果

34 例患兒全部進行基因檢測，其中28 例為復合雜合突變，4 例為純合子突變，2 例僅攜帶1 種突變。共檢出40 種IVD基因突變位點，其中錯義突變30 種（75.00%），12 種為新發錯義突變，分別為：c.958 G＞A、c.1174 C＞T、c.458 T＞C、c.994 A＞T、c.919C＞T、c.380T＞C、c.1012G＞T、c.1061A＞G、c.476G＞C、c.1016G＞A、c.1195G＞C、c.1232A＞C。另還有1種缺失突變（c.724_726del），1種基因內重復（chr15:40699822‐40708584，hg19），大小為8.76 kb，1種缺失插入突變（c.466‐3_466‐2delinsGG）。最常見的突變位點為：c.1208A＞G（n=8）。臨床表現與基因變異類型未見明顯相關性。

2.6 治療

IVA 患兒急性期治療主要為維持內環境穩定和對癥處理，限制亮氨酸攝入，10%葡萄糖補充能量，靜脈滴注碳酸氫鈉糾酸，給予左卡尼?。咳?00～300 mg/kg）和甘氨酸（每日250～600 mg/kg）促進異常代謝物排出，伴嚴重高氨血癥患兒給予苯丁酸鈉或苯甲酸鈉，1例患兒發病時因高氨血癥行血液透析治療。

間歇期治療給予去除亮氨酸營養粉治療。29例患兒根據病情嚴重程度，每天將普通食物與去除亮氨酸營養粉按1∶（1～3）比例喂養，或限制天然蛋白質的攝入，每日蛋白總攝入量至少達到同年齡同性別健康兒童推薦量的最小值；1例因病情較輕，未予去除亮氨酸營養粉治療。30 例口服左卡尼汀，劑量為每天50～100 mg/kg，分3～4次給予。29例口服甘氨酸，劑量為每天150～200 mg/kg，分3～4次給予；1例患兒因病情較輕，未用甘氨酸治療。攝入蛋白量及相關藥物劑量根據患兒臨床表型、生化指標、血串聯質譜、尿氣相色譜監測行個性化治療。

2.7 隨訪

中位隨訪時間為5年8個月（范圍1年3個月～7年9個月）。隨訪至2023年12月，急性新生兒型患兒共4例死亡，中位死亡年齡為8 d（范圍4～50 d），死因中均有失代償性代謝性酸中毒；其余11例中9 例出現智力發育落后（4 例患兒因家長拒絕行智力測試，僅由有經驗的臨床醫生綜合評估），2 例（例10、例13）智力發育邊緣水平。3例慢性間歇型患兒發育落后，其中2例（例18、例19）表現為智力發育落后，1例（例17）表現為運動發育落后，活動耐力差，肌力下降。見表2。16例新篩檢出無癥狀型患兒未見明顯臨床癥狀。

表2 IVA部分患兒發育評估結果

30例存活IVA患兒最近1次隨訪時與治療前質譜檢測結果詳見表3。與治療前相比，最近1次隨訪時尿中異戊酰甘氨酸水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），血中C 5 水平、C 5/C 2 比值和C 5/C3比值差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 IVA存活患兒30例最后1次隨訪與治療前質譜指標比較

3 討論

IVA 是最早明確診斷的常染色體隱性遺傳的有機酸血癥[1]，該病缺乏特異性臨床表現，新生兒期有喂養困難、嘔吐、脫水、嗜睡、昏迷、抽搐等非特異性臨床表現，可發生急性腦病、代謝性酸中毒、高氨血癥，慢性間歇期有反復嘔吐、喂養困難、生長遲緩及智力障礙等，也有罕見的胰腺炎發作、肝纖維化、視神經萎縮等[11]。如不及時處理急性分解代謝異常，預后則不佳。本研究中死亡的4 例患兒均于新生兒期急性發病，未行新生兒篩查。有3例急性新生兒型患兒在出具新生兒篩查結果后明確診斷為IVA，患兒得到早期診斷與治療，隨訪至今，該3例患兒中有2 例生長發育正常，1 例有生長發育落后，常規生化檢測結果未見異常。隨著新生兒篩查的應用，越來越多的無癥狀IVA 患兒得到診斷。本研究中超過半數患兒通過新生兒篩查檢出，16例無癥狀患兒隨訪至今，均無明顯臨床癥狀，常規生化結果均未見異常。研究表明，異戊酸等代謝產物通過誘導氧化應激抑制大腦皮層鈉鉀 ATP酶活性從而引起神經系統損傷[16]。IVA的代謝危象發生時間、早期診斷與良好的神經認知結局相關。一項對155 例有癥狀IVA 患兒的分析表明，在出生后5周內診斷的患兒中，在初始代謝危象期間的病死率占1/3，而此后診斷的患兒病死率僅為3%；出生后5周內明確診斷并獲得治療的IVA患兒僅有15%出現神經系統損傷，而后期診斷的IVA患兒45%會出現神經系統損傷，神經系統的受損程度與診治早晚有關，與疾病的急性發作次數及嚴重程度無關[17]。故新生兒篩查有助于疾病早診斷、早治療，降低IVA患兒病死率，改善IVA患兒預后[18]。

隨著血串聯質譜和尿氣相色譜技術在新生兒篩查的廣泛應用，越來越多的患兒在臨床癥狀出現前已獲得明確診斷。一項納入160 萬德國新生兒的大型研究發現，新生兒篩查檢測到的IVA病例中，近一半（11/24）被定義為“輕度或中度代謝異?！?，隨訪這些患兒，可能終生無癥狀[2]。這也與本研究結果相一致。血C5是IVA的生物標志物之一，但由于C5和2‐甲基丁酰肉堿是同分異構體，還需結合C5/C3和C 5/C 2 比值升高以及尿中異戊酰甘氨酸升高綜合判斷，與新生兒短鏈?；o酶A 脫氫酶缺乏癥相鑒別。此外，有些抗菌藥物如匹氨西林、頭孢菌素及特戊酸酯軟膏含特戊酰肉堿，其使用會導致血中C5水平暫時性增高[19]。因此，尿異戊酰甘氨酸增多被認為是診斷 IVA 的特征性指標。一項來自西班牙的研究分別將血C 5 濃度6 μmol/L、尿異戊酰甘氨酸濃度195 mmol/mol肌酐作為切值，將IVA分為代謝輕型和代謝嚴重型，并以此長期隨訪代謝嚴重型患兒[20]。監測尿異戊酰甘氨酸濃度相比血C 5 水平更能評估疾病進展及預后情況。在本研究隨訪的30例存活IVA患兒中，經過治療，尿異戊酰甘氨酸濃度顯著下降，但本研究納入各組患兒數量較少，無法用統計學方法分析出各組指標與疾病嚴重程度及預后的相關性。在長期的隨訪治療中，仍缺乏確定的實驗室檢測指標監測疾病控制狀態[21]，可能需要通過擴大樣本數量及長期隨訪得以進一步明確。

目前已報道超過90 余種IVD基因變異（http://www.hgmd.org），其中多為錯義突變[22]。本研究有2例患兒僅攜帶1 個突變位點，這可能與基因檢測方法有關，也許存在小片段的基因缺失或重復序列未檢測出，或是基因內含子區域的變異導致基因剪接異常，或存在特殊的基因修飾，對該2 例患兒，將繼續采用不同方法驗證上述猜想。關于IVD基因變異，不同國家或地區的熱點變異有地域差異：美國及德國為c.932C＞T (p.A282V)[21]，南非為c.367 G＞A (p.G123R)[8]，韓國為c.457‐3_2CA＞GG[23]，泰國為c.457‐3_2CA＞GG[24]，中國臺灣地區為c.1208A＞G(p.Y403C)[4]。相關研究報道了3例不典型IVA的兒童患者[25]，檢測到6 種基因突變位點：c.157 C＞T、c.214G＞A、c.1183C＞G、c.1208A＞G、c.1039G＞A和c.1076 A＞G。另有研究報道了8 例IVA 患者，發現14種基因突變類型，其中c.1208A＞G占比最多[22]。中國柳州地區對2 095 名正常新生兒進行了高通量測序，檢測到了10例IVD基因攜帶者，其中多達5例為c.1208 A＞G 突變位點攜帶者[26]。根據本研究和其他國內研究中檢測到的IVA患兒的IVD基因變異類型，推測c.1208A＞G突變在中國具有較高的頻率。目前尚無關于中國IVA 患者突變譜和熱點的報告。然而，該變異位點是否是中國人群的熱點突變，可能需要通過擴大樣本量進一步驗證。在基因型與臨床表現或生化代謝相關性方面，有文獻報道c.932C＞T(p.A282V)突變與無癥狀型IVA最為相關[2]，而在本研究中，無癥狀型IVA患兒無發現攜帶此突變。文獻報道的2例攜帶c.640A＞G(p.T214A)突變的IVA患兒為無癥狀型[27]。本研究中有2例攜帶同一突變位點的患兒同樣無明顯臨床癥狀，但按照生化代謝型分類分別屬于“代謝輕型”及“代謝嚴重型”，中國浙江省新生兒篩查檢出攜帶這一變異的2例患兒，有1例曾發生高氨血癥[5]。這提示IVD基因變異具有臨床表現異質性，基因型與臨床表型和生化表型的關系還須進一步探索。

綜上，本研究發現IVA 患兒臨床表現無明顯特異性，血C5、C5/C2比值和C5/C3比值及尿異戊酰甘氨酸增高對診斷異戊酸血癥具有特異性。新生兒期急性發病的患兒病情危重，病死率高。未發現基因變異類型與臨床表現有明顯相關性。新生兒篩查有助于該疾病的早期診斷、治療及預后。此外，因新生兒篩查檢出僅有輕微生化異常的“無癥狀”患兒，其發生嚴重分解代謝風險及遠期結局仍不明確，還需進行長期隨訪觀察。