微乳液中酶催化反應及W/O乳液結構穩定性研究

張義豪,劉笑彤,徐國峰,王文君,王曉敏,李群,許瑞,杜中玉*

(1.濟寧醫學院 基礎醫學院,山東 濟寧 272067;2.兗州區實驗高級中學,山東 濟寧 272100)

微乳液,在1943年首次由Hoar和Schulman發現,是一種由表面活性劑、助表面活性劑、油與水等組分在合適比例下組成的無色、低黏度的,溶液中粒徑在10～100 nm的體系,表現為透明和半透明狀,是熱力學穩定體系。1959年由英國化學家Schulman首次將上述體系稱為微乳狀液或微乳液。

自微乳液發現后,圍繞著它提出了多個理論,在Schulman和Prince等的混合膜理論、Schulman和Bowcott等的雙層膜理論、Robbins、Mitchell和Ninham等人的幾何排列理論和R比理論。在這幾個的理論中,Winsor等發展的R比理論更加完善,更被認可。通過R比理論可以將微乳液分為四種類型。R比理論以分子間相互作用力為基礎,認為微乳液各組分之間必然存在著相互作用力,各個相互作用力之間疊加的最后決定了膜的性質,由此可用Aco表示油與表面活性劑之間的內聚能,表面活性劑之間的內聚能用Acw來表示,用AⅡ表示表面活性劑親油基之間的內聚能,將Ahh定義為表面活性劑親水基之間的內聚能,而Aoo則為油分子之間的內聚能,Aww為水分子之間的內聚能。由此定義,R=(Aco-Aoo-AⅡ)/(Acw-Aww-Ahh),并由公式可得,當R<1時,會形成水包油型微乳液,即為WinsorⅠ型,當R≈1時,會形成雙連續型微乳液,微乳液為WinsorⅢ型,當R>1時,形成的油包水型微乳液類型為WinsorⅡ型,而當表面活性劑合適時,會形成單相體系的特殊形式的WinsorⅢ型微乳液,并將之命名Wirier Ⅳ型微乳液[1]。

微乳液的理論和應用發展極為迅速,已經被廣泛應用于洗滌去污、催化、化學反應介質和藥物傳遞等領域中。而酶參與的催化反應一直是生物學與化學交叉研究的重要領域,在酶催化的反應體系中如何保持和提高酶的活性是關鍵,而酶的活性又被反應介質和反應時的微環境影響,因此尋找能夠更好地保持和提高酶活性的微環境和介質一直是科研工作中的重點[2]。而WinsorⅡ型微乳液,即油包水型微乳液(W/O)其大的界面積、底物溶解性的增強和能在分子水平上分散酶等特點都有利于酶催化反應的進行,而且由于界面膜的存在使得酶的活性得到了保障。

1 微乳液中的酶催化酯化反應

酶是具有高效和特異催化作用的蛋白質。催化劑只會加速化學反應達到平衡點,但不會改變平衡點。酶也是如此,但與非酶催化劑相比,酶具有極高的催化效率;此外,酶僅催化特定物質的某些化學反應,產生一定產物而不產生副產物,即酶具有極高的特異性。酶的催化能力稱為酶活性,酶量的多少可以測量酶的活性。同時,酶的活性受各種環境條件影響。

酯化方法是羧酸和醇在少量無機酸存在下加熱而轉化成酯的有機合成方法。常用的無機酸有濃硫酸和干燥的氯化氫等。酯化反應一般反應過程長,反應副產物多,且反應為可逆反應,故需要酶催化以加快反應進程,控制反應產物,促進反應向目標產物方向進行。酯化反應的速率受多種因素的影響,在微乳液酶催化酯化反應當中,除環境因素外,表面活性劑的選擇也是重要影響因素。

1.1 不同表面活性劑對微乳液中酯化反應的影響

酯化反應是微乳液中重要的化學反應之一,而不同表面活性劑對微乳液中酯化反應的影響不盡相同。微乳液中酶催化所用活性劑分為陽離子型、陰離子型、兩性型和非離子型表面活性劑。其中大多數酶促反應在雙(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)表面活性劑應穩定的微乳液中進行,李干佐等人[3]就曾研究了CTAB/異辛烷/正戊醇/緩沖溶液中糖化酶催化淀粉的水解反應。研究顯示其最大反應速率和米氏常數比起在水溶液分別提高了近6倍和3倍。Han等人[4]則用DBSA作為表面活性劑,建立DBSA/環己烷微乳液體系,并用圓柱假絲酵母脂肪酶(Ccl)催化乙醇與乙酸作為酯化反應模型,與AOT/環己烷微乳液體系進行比較。研究表明在DBSA體系中酯化反應速率及轉化率大于AOT體系。其原因在于DBSA具有雙重功能,即表面活性劑和酸催化劑,二者的協同作用使DBSA體系有更高的反應速率。近年來,反膠束的形成也成了人們研究的熱點。Zheng等人[5]研究合成了一種Bronsted酸性-表面活性劑復合離子液體,3-(N,N-二甲基十二烷基銨)丙磺酸硫酸氫([SB3-12][HSO4]),它具有疏水尾部、親水陽離子和Bronsted酸性反離子[SB3-12][HSO4],在油酸和乙醇的混合物中形成反膠束,促進酯化反應。其形成的反膠束具有親水性,因此反應過程中產生的產物酯可有效的排除在反膠束以外,反應生成的水可以自動進入到反膠束,并且[SB3-12][HSO4]的自聚集會使酸性催化劑在反膠束界面集中。反膠束可以增強酯化反應和微分離器自動分離反應過程中產生的水和油酸乙酯,有利于酯的形成。油酸乙酯中水的分離既阻止了油酸乙酯的水解,又迅速促進平衡向產物油酸乙酯轉移。此外,相較于前文提到的DBSA體系,該催化劑的高催化活性以及易于重復利用性,使其更加高效環保的應用于油酸乙酯的合成。表面活性劑對微乳液中酯化反應速率的提高還受溫度、pH值、反應時間、反應物用量等影響。因此,在適宜的溫度、pH值等條件下選擇合適的緩沖體系和活化劑,對微乳液中的酯化反應具有重要意義。

1.2 內部“水池”環境對于酶活性的影響

1.2.1 水池大小對酶活性的影響

油包水微乳液具有一定大小的“水池”,含水量大小常以水與表面活性劑物質的量比ω0表示,即ω0=[H2O]/[SAA]。多項研究表明,每種酶在固定的反應體系中都有一個最適的“水池”大小值,當ω0很小或者較大時均會導致酶的活性降低。周國偉等人[6]在烷基聚葡糖苷微乳液中脂肪酶催化的酯合成反應動力學研究中表明,當烷基聚葡糖苷濃度增大時反應初始速率v0反而有所減小,這可能是因為隨烷基聚葡糖苷濃度增大,體系中微乳液“水池”的總體積增大,酶的濃度減小、流動性增大,引起酶的增溶位置及活化構象發生某種變化,從而導致反應初始速率v0減小。此外,底物濃度下降也是酶活力降低的因素之一。當ω0較小時,酶的活力相對較低,可能是由于不能滿足酶分子周圍需要的一層必須水,而影響了酶活化構象的形成。

1.2.2 pH值對酶活性的影響

酶催化反應的重要特性之一是對微乳液微環境的pH值極其敏感,酶表面的電荷密度隨pH值的變化而變化,從而導致酶與表面活性劑頭基的相互作用產生變化。最適pH值的選擇與酶種類、反應類型有關。最適pH值的微小偏離可使酶活性部位的基團離子化發生變化而降低酶的活性;較大偏離時,維護酶三維結構的許多非共價鍵受到干擾,導致酶蛋白的變性。

Kriegera等人[7]在AOT/異辛烷反膠束中,分別加入不同的緩沖溶液,研究PCL催化三油酸甘油酯的水解反應。緩沖溶液分別為乙酸鹽(pH值=4.0～5.5)、磷酸鹽(pH值=6.0～8.0)和Tris-HCl(pH值=8.0～9.0)。研究表明,酶的活力與pH值的大小呈鐘形曲線,在pH值=8時酶的活性最大。同時研究還發現,不同的緩沖液對于酶的活性也有影響。該反應在磷酸鹽溶液中酶的活力相較于在Tris-HCl緩沖液中更強。

2 水包油包水的穩定性研究

水包油包水(W/O/W)的最內部由單一水相W1組成,隨后被較大油滴包裹,形成油/水乳液,該乳液再次分散到另一個水相中,從而形成了一個比較復雜的多相系統。由于其獨特的多組分結構,它們應用范圍很廣,且具有很大的應用潛力。其中水在油滴中保持對于這些應用來說至關重要,但是,這種系統非常不穩定,可能會發生內部水滴之間的聚結、外部油滴之間的聚結,內部水滴和外部水相之間的聚結及擴散等,應用起來具有挑戰性,比一般簡單的單相乳液困難得多。因此研究其內部WO乳液的結構及其穩定性尤為關鍵。

2.1 內部WO乳液分散水相的平均液滴直徑對微乳液平衡的影響

內相的液滴尺寸分布(W1)有著至關重要的作用,影響微乳化液的產品性能和平衡。不同粒徑分布的穩定乳液主要取決于內部W1/O的處理參數,利用PFG-NMR測量內相(W1)的液滴尺寸分布和O相的表征,研究表明內部WO乳液分散水相的平均液滴直徑小,可使油滴內部水相均勻分布,從而增加與外水相聚結的穩定性[8-9]。當直徑足夠小(<1 mm)時,才能更好的適應液中典型尺寸的油滴[10-11]。

2.2 滲透活性物質的加入對微乳液穩定性的影響

滲透活性物質(OAS)在乳液中發揮著至關重要的作用。Neumann等[12]以氯化鈉、氯化鈣和葡萄糖作為OAS,聚甘油-聚蓖麻油酸酯為親脂性乳化劑制備了WO乳液,通過測量界面特性和乳液黏度來評估液滴的穩定效果。實驗指出OAS不影響油相張力,也不影響乳液黏度,用于內部水滴,來限制乳液中水相之間的擴散過程,也可以通過影響內部乳液的結構,添加到內部水相的滲透活性物質,如某些電解質,會改變吸引力,從而減小水滴直徑,來增加微乳液的穩定性,但必須使用足量的OAS來限制擴散引起的液滴成熟。據Ficheux[13]和Pays[14]等人研究表明OAS可以平衡拉普拉斯壓力帶來差異,以及可能會改善基于拉普拉斯壓力的差異所帶來的效應即內水相與外油相液滴聚合而導致平均液滴直徑增加,乳液破裂,內部水相損失,出現典型的液結構的損失。

2.3 內部滲透壓力對微乳液穩定性的影響

內部水相與外水相之間的滲透壓力梯度可以導致水分子的擴散,當內部W1的溶質濃度高于外部W2的溶質濃度時,會使水分子進入內部水滴存在驅動力,使內部的水滴膨脹,反之,會使內部水相收縮[15]。通過向內部分散相中添加溶質,利用滲透壓梯度來抵消拉普拉斯壓力,來提高穩定性。但同時,也需要在外部水相加入少量溶質,雙重作用使其產生更穩定的多相乳液,但微乳液被不含鹽的緩沖液稀釋后,W2溶質濃度遠遠小于W1,這將導致水分子從外水相運動到內水相,使內部發生膨脹[16]。

2.4 內部分散的液滴凝膠化對微乳液穩定性的影響

內相液滴凝膠化可以利用球狀蛋白加熱至其熱變性溫度來發生,加熱后,W1中的球狀蛋白展開,通過疏水鍵和二硫鍵相互聚集來提高系統的黏性和凝膠強度[17-18]。將內部水相(W1)含有20%乳清蛋白分離物(WPI)的緩沖溶液(pH值7,250 mmol/L氯化鈉)制成W1/O/W2的微乳液,對其進行不同程度稀釋和熱處理,使W1的球狀蛋白熱凝膠化,使疏水性增加,進而導致系統黏度增加,穩定性提高。Iqbal等人[17-18]對內部分散相進行熱變性,使其凝膠化,通過觀察不同溫度對微乳液W1/O/W2復合剪切模量的影響,指出流變變化是熱不可逆的,并將其歸因于WPI內球狀蛋白的不可逆熱性,球狀蛋白經歷了熱凝膠化后,疏水性增加,使其在油滴之間形成聯系,使系統黏度增加,同時影響多種乳液的穩定性。

2.5 乳化劑對微乳液穩定性的影響

許多研究小組研究了不同乳化劑的類型和濃度對液穩定性的影響,短鏈乳化劑有被證明從一個水相擴散到另一個水相,它們進入W/O/W液的內部水滴中會破壞液滴的穩定性,而生物聚合物如蛋白質和親水膠體被假設有更好的穩定性能乳液,因為它不大可能擴散通過油膜并進入內部水滴,所以與短鏈乳化劑相比,大分子乳化劑甚至穩定劑更適合穩定液[14,19]。生物聚合物主要通過增加內外水相的黏度或凝膠程度等多種機制來提高乳液的穩定性[20-21]。它在微乳液中起到雙重作用,既可以作為功能成分,減少有關此類配方中合成微乳劑的使用;也可以作為穩定成分,其不易從內外水相遷移和擴散,且可以在分散和連接的水相中形成網狀結構,使黏性提高,表面活性生物聚合物還可以作為黑白乳化液滴外油水界面的有效穩定成分。

3 微乳液發展展望

不同微乳液體系已經被廣泛研究,在微乳液中各種酶催化反應也成為重要研究對象,對于酶催化反應的研究大多數是在改變微乳液內部水相的內部環境或者不同的表面活性劑、溶劑和助表面活性劑來提高酶催化反應速率。而目前新型的水包油包水(W/O/W)在不同的工業領域作為封裝系統或在食品工業中作為潛在脂肪替代品起到關鍵作用。微乳液的研究趨近成熟,如何更好地應用將成為關鍵。微乳液的內部環境可以用來模擬細胞內環境,希望在應用于工業封裝、食品生產等領域的同時,未來研究應集中于研究更加穩定的制備方法和增強其長期穩定性的技術,使其內部可以發生更加復雜反應,為生物化學反應、藥物合成反應提供更加廣泛的應用前景,為醫學發展、人類健康作出貢獻。