天然纖溶酶的來源及生產方法研究進展

彭粹盈，王盼盼，鄧雄偉，謝小梅，翁美芝*

（1.江西中醫藥大學 中醫學院，江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學 南昌市洪都中醫院，江西 南昌 330008）

心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）是一種常見的易致死疾病，根據世界衛生組織（world health organization，WHO）提供的數據，心血管疾病每年奪去1 790萬人的生命，占全球死亡人數的31%[1]。目前，我國約有心血管病患者3.3億，心血管病死亡率占居民疾病死亡構成的44%以上，高于腫瘤及其他疾病。而血栓形成是導致心血管疾病中缺血性腦卒中、心肌梗死和靜脈血栓栓塞癥等的主要原因[2]，多年來，抗凝劑如華法林、達比加群和利伐沙班等被用于溶解血凝塊[3]。然而，這些藥物除了生產成本高外，還存在不良反應，如出血、食管炎、心肌梗死、肝損傷等[4-5]。另外，纖溶酶原激活劑，如尿激酶、鏈激酶和組織型纖溶酶原激活劑也被用于治療血栓。但是，這些治療方法均有報道過會導致出血等致命并發癥[6]。由于這些不良副作用，新一代的溶栓藥物應具備安全性好、副作用少、半衰期長、價格便宜、溶栓效率高等優勢。近些年，天然來源的纖溶酶被廣泛研究，其在溶栓治療中變得非常重要。

纖溶酶是一種蛋白水解酶，能有效降解纖維蛋白（血栓），是纖溶系統中重要的組成部分[7]。在人體正常生理狀態下，纖維蛋白的降解和形成過程是一種穩態的平衡。然而當這種穩態被破壞，纖維蛋白不能及時水解而聚集，就會促進血栓形成，誘發心肌梗死、缺血性腦卒中和動脈粥樣硬化等疾病的發生[8]。因此，在溶栓治療中，能快速溶解血栓并重新恢復正常血流尤為重要。

近年來有許多學者對自然來源的纖溶酶進行了大量研究，主要集中在酶的來源、生產工藝、分離純化、理化性質、酶的應用和酶的體內外溶栓效果等方面，這為開發安全性高、療效好、價格低廉的天然溶栓藥物奠定了基礎，拓寬了纖溶酶高值化利用的新途徑。本文綜述了血栓形成及纖溶酶的作用機制，總結了纖溶酶的來源（海洋微生物、發酵食品微生物、植物和動物）和生產方法，旨在推動纖溶酶的發展和應用，使其成為一種具備增值潛力的資源提供理論參考。

1 血栓形成和纖溶酶的作用機制

1.1 血栓形成機制

纖溶酶的主要作用是溶解血栓，因此在討論纖溶酶的來源之前，有必要探討血栓形成和纖溶酶的作用機制。血栓形成是指血管內限制或阻塞血流的病理性凝塊形成，其與血液凝固密切相關[9]。血栓形成主要有兩種類型，靜脈血栓和動脈血栓。靜脈血栓也被稱為紅血栓，富含血細胞，與內皮功能障礙和凝血系統激活有關；動脈血栓形成與血小板活化有關，被稱為白血栓。血栓的形成主要包括血小板的粘附聚集和凝血級聯反應過程。當血管內皮細胞的結構和功能受到破壞時，許多粘附大分子被暴露在血液中，與血小板表面受體糖蛋白相互作用，之后血小板整合素構象的轉變觸發血小板積累和聚集，促成血栓的形成。凝血級聯包含三種途徑（外源性凝血途徑、內源性凝血途徑和共同途徑）[10]。在凝血途徑中，每個凝血因子由一種酶原組成，酶原通過上游活化的凝血因子轉化為活性酶。外源性凝血途徑涉及凝血因子I、II、VII和X等，始于組織因子（tissue factor，TF）和激活的凝血因子VII，直接誘導凝血因子X和凝血酶原的按序激活。內源性凝血途徑則始于凝血因子XII的裂解，最后形成因子Xa。當因子Xa由內源性或外源性途徑形成時，需要另一種共同途徑來形成纖維蛋白網。在共同途徑中，凝血酶原首先被Xa激活為凝血酶，凝血酶激活纖維蛋白原形成纖維蛋白。同時，血小板粘附在受損的血管上，纖維蛋白與血小板一起聚集，血栓形成[11]。

1.2 纖溶酶作用機制

血栓溶解是指粘附在血小板周圍的纖維蛋白網絡的溶解，包括纖溶酶原被激活的間接作用機制和由纖溶酶類酶引起的直接作用機制。通常來說，間接作用機制是正常生理過程，主要是組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，t-PA）或尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator，u-PA）激活纖溶酶原為纖溶酶，另一方面，直接作用機制是纖溶酶直接降解纖維蛋白網狀結構。最終，纖溶酶將纖維蛋白降解為可溶性纖維蛋白降解產物[9]。一些溶栓藥物，如尿激酶、鏈激酶和葡激酶等都屬于纖溶酶原激活劑，它們通過激活纖溶酶原轉變為纖溶酶降解纖維蛋白；納豆激酶和蚓激酶等可以直接水解纖維蛋白網，使血栓溶解[12]。

2 纖溶酶的來源

2.1 微生物

2.1.1 海洋微生物

海洋微生物是纖維蛋白溶解酶的重要資源，產纖溶酶海洋微生物的來源、種類及所產纖溶酶的特性見表1，它們大部分是細菌，所產酶的類型為絲氨酸蛋白酶，且纖溶酶活性在一定范圍內維持穩定。ZHAO L H等[13]從海洋衍生的真菌雜色曲霉（Aspergillus versicolor）中鑒定出一種新的雙功能纖溶酶，其分子質量為37.3 kDa，在溫度40.0 ℃和pH 5.0時表現出最大酶活性，并且該酶還顯示出溶栓和抗凝雙重活性。為了提高纖溶酶的產量，降低成本，滿足工業化生產，PANSH等[14]從海洋微生物中分離出一種細菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）D21-8，經過其發酵工藝參數優化，獲得酶活力高達3 787 U/mL。龐光武等[15]對來自海洋的枯草芽孢桿菌LC6-1進行紫外誘變得到突變菌株PW6-3，并對培養基組分優化，菌株PW6-3產酶量較之前提高了72.53%?？傮w來說，芽孢桿菌屬的海洋微生物是生產纖維蛋白溶解酶的重要資源。

表1 產纖溶酶海洋微生物的來源、種類及所產纖溶酶的特性Table 1 Sources, species and characteristics of fibrinolytic enzymes produced by fibrinolytic enzyme producing marine microorganisms

2.1.2 發酵食品微生物

發酵食品中的微生物已被證明是纖溶酶的重要來源，翁美芝等[22]在淡豆豉發酵過程中篩選鑒定出3種產纖溶酶的優勢菌株，分別是枯草芽孢桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和微球菌（Micrococcus），并用純種液體發酵發現枯草芽孢桿菌的酶活力達527.49IU/mL。KIM C等[23]在韓國發酵食物中發現腌魚中存在纖溶酶活性，通過凝膠過濾和離子交換色譜法純化了兩種名為JP-I和JP-II的新型纖溶酶，其分子質量均為36.0 kDa；纖溶酶JP-I在50.0 ℃和pH 8.1時溶解活性最高，而JP-II在45.0 ℃和pH 9.9時活性最高，且兩種酶在較寬的pH值范圍內表現穩定。在印度尼西亞的納豆中分離出一種細菌枯草芽孢桿菌G8，利用全血凝塊溶解、優球蛋白凝塊溶解和纖維蛋白平板法與納豆激酶進行比較，發現枯草芽孢桿菌G8所產纖溶酶能夠溶解全血和優球蛋白凝塊，且枯草芽孢桿菌G8的粗提取物顯示出六個酶譜帶：42.0 kDa、35.5 kDa、30.8kDa、26.7kDa、20.0 kDa和13.7 kDa，尤其是在20.0 kDa處觀察到最強活性[24]。這些研究大部分集中在從傳統發酵食品發酵過程中，分離出來的微生物生產蛋白酶上，其中一些蛋白酶能水解食品中富含的蛋白質，從而為其生長提供營養物質；一些蛋白酶能降解纖維蛋白，使發酵食品具有纖溶活性，產纖溶酶發酵食品微生物的來源、種類及所產纖溶酶的特性見表2。發酵食品中發現的微生物大部分是細菌，尤其是芽孢桿菌，因其分布廣泛且安全性好，被認為是最常見的蛋白酶生產者[25]。雖然已經發現了發酵食品中許多微生物能生產纖溶酶，但對微生物的研究還是較少，微生物在食品發酵過程中產生對纖維蛋白具有特異性活性的纖溶酶機理還有待進一步研究。

表2 產纖溶酶發酵食品微生物的來源、種類及所產纖溶酶的特性Table 2 Sources, species and characteristics of fibrinolytic enzymes produced by fibrinolytic enzyme producing fermented foods

2.2 植物

一些研究表明，植物提取物或分離化合物能促進纖維蛋白溶解，如石蒜、烏頭葉花棘麻和刺猬黃瓜等[32-35]。AHAMED N A等[36]從植物蘆薈的根中分離出產生纖溶酶的內生菌株，經過培養基組分優化發現，牛肉和酵母提取物能提高纖溶酶的產量，Ca2+和Mg2+能夠增加纖溶酶的產生。在一項隨機交叉實驗中，給與人體干大蒜粉（900 mg/d；持續14日；安慰劑對照研究）后t-PA活性增加，但纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）和纖維蛋白原水平不受影響[37]。這些產纖溶酶植物的來源廣泛，種類較多，其所產纖溶酶大部分屬于絲氨酸蛋白酶家族，分離得到的纖溶酶大部分來源于傳統草藥（見表3）。它們在體外實驗中表現出較高的纖溶酶活力和較好的特異性，但這些實驗觀察到的結果可能是植物蛋白酶的存在，又或者可能是植物材料中存在的各類植物化學物質，對纖維蛋白溶解酶調節的結果。在整個生物體的水平上，促進纖維蛋白溶解或抗血栓形成作用的分子機制非常復雜。植物來源的物質能夠影響止血系統的不同成分[38]，包括刺激纖維蛋白溶解系統、調節凝血級聯反應和血小板活性等。

表3 產纖溶酶植物的來源、種類及所產纖溶酶的特性Table 3 Sources, species and characteristics of fibrinolytic enzymes produced by fibrinolytic enzyme producing plants

2.3 動物

蛇的毒液是纖溶酶的重要來源，能直接降解纖維蛋白，臨床研究表明其給藥后，溶栓效果好[45]。但由于其來源特殊，制作工藝不同，保存運輸費用高，質量難以控制，因此在臨床上，其應用少于其他同類溶栓藥物。蚓激酶是從蚯蚓中提取的一組蛋白水解酶。據報道，健康成人服用蚓激酶較安全[46]，但是其治療作用相對較慢。水蛭素是從水蛭中分離出來的一種纖溶酶。REN K Y等[47]研究重組葡萄激酶-水蛭素融合蛋白的體外凝血模型和動物模型發現其溶栓效果明顯，可以預防和減少溶栓后的再栓塞，降低抗凝藥物聯合用引起的出血副作用。但由于水蛭口服的吸收效果較差，在鼻腔給藥方面的研究較多[48]。XAVIER M A等[49]在寄生蟲的體內發現了一種蛋白質BmCL1，通過基因重組BmCL1發現其能利用Aα和Bβ鏈水解纖維蛋白原。綜上，動物來源的纖溶酶研究較多（見表4），它們所產纖溶酶的分子量較小，尤其是蚯蚓來源的纖溶酶分子質量最小為14.0 kDa；扇頭蜱、寬體金線蛭和蝮蛇在pH值為7.5～8.0時產生的纖溶酶活性較高，但是一些動物來源的纖溶酶作用方式不同，仍然需要進行全面系統的研究。

表4 產纖溶酶動物的來源、種類及所產纖溶酶的特性Table 4 Sources, species and characteristics of fibrinolytic enzymes produced by fibrinolytic enzyme producing animals

3 纖溶酶生產方法

3.1 發酵法

在發酵工藝中，高產纖溶酶的重要因素就是對固態發酵和液態發酵的方法進行優化，包括菌種的選擇，經濟環保的培養基，發酵條件中的營養（碳源、氮源和金屬離子源）、pH值、溫度和時間等。王明瑞等[55]以玉米粉為主要培養基對蛹蟲草進行固態發酵，優化發酵參數后，蛹蟲草所產纖溶酶在血纖維蛋白平板上形成的溶解圈面積為169.34 mm2。MOHARAM M E等[56]用枯草芽孢桿菌Egy進行固態發酵生產纖溶酶，優化發酵條件后枯草芽孢桿菌產生的纖溶酶活力達141.02 U/g，且體內細胞毒性評估實驗結果顯示，在治療后的前24 h內老鼠沒有死亡，肝臟和腎臟的組織病理學檢查顯示結構正常。在優化發酵過程中，影響因素非常多，為了使實驗更具合理性，通常采用兩種或兩種以上的方法組合使用。除了優化發酵培養基和發酵條件外，微生物固定化發酵也可用于提高酶的產率。GUO N等[57]用磁性固定的方法將納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）固定在銀杏種子上，以銀杏發酵種子的纖維蛋白溶解活性為參數，通過Plackett-Burman和Box-Behnken設計方法進行優化后纖溶酶活性達到（3 175±43）IU/g。雖然獲取纖溶酶的發酵方法在不斷優化和改進，但對于工業化生產來說，纖溶酶產量仍然很低，且影響該過程產酶量的因素非常多。

3.2 生物技術法

針對目前需要大量生產纖溶酶來說，低成本、效率高的重組技術生產纖溶酶的方法受到廣泛關注。生物技術法的應用主要包括兩個方面，提高纖溶酶的產量以及菌株在發酵劑培養中的纖溶活性。ZOU Y等[58]開發應用了一體化質粒CRISPR-Cas9系統，用于枯草芽孢桿菌的迭代基因組編輯，只需要一個質粒轉化和固化，就能加速基因組編輯的周期，且使用該系統連續敲除兩個細胞外蛋白酶基因epr和bpr，2.5 d就能完成一輪基因組編輯，采用工程菌株表達豆豉纖溶解酶DFE27，纖溶酶活性達到159.5 FU/mL。YAN G B等[59]使用畢赤酵母（Pichia pastoris）異源表達系統表達來自納豆枯草芽孢桿菌（B.subtilis natto）NK-Bs的納豆激酶，構建攜帶1～7個納豆枯草芽孢桿菌的aprN基因拷貝的表達菌株，當靶蛋白的表達水平在靶基因的五個拷貝處達到最大值，同時將攜帶單個aprN基因拷貝的畢赤酵母用于搖瓶和高密度發酵，結果顯示搖瓶發酵的蛋白產量為320 mg/L，高密度發酵的蛋白產量約為9.5 g/L，且重組納豆激酶表現出較高的熱穩定性和pH穩定性。除了應用外源表達來提高纖溶酶的產率之外，也可以通過突變和蛋白質工程等方法對產纖溶酶的微生物進行修飾。HAN L C等[60]用甘油作為碳源，用抗終結蛋白GlpP及其靶序子PglpD在枯草芽孢桿菌中構建高效的甘油誘導表達系統（glycerolinducible expression system，GIES），枯草芽孢桿菌通過對葡萄糖和甘油的順序利用，GIES能夠以自誘導的方式表達基因，其中甘油的濃度可調節基因表達的強度，葡萄糖的濃度既影響誘導的時間，也影響基因表達的強度，GIES也進一步應用于納豆激酶的高產量生產?？偠灾?，現代分子技術為發現新的纖溶酶以及改善其催化性能提供了良好的機會，生物技術工具對纖溶酶的可持續生產發揮了重要作用。

4 總結與展望

纖溶酶潛在的醫學價值較高，來源廣泛，包括微生物、植物和動物，其中微生物來源中的細菌是產纖溶酶的主要來源。到目前為止，纖溶酶生產方法仍處于研究階段，還存在許多問題。第一，纖溶酶質量評價還有待提高，其評價目前主要依賴于酶活性的測定，尚不全面，應結合其在不同溫度、pH值等影響因素下的穩定性評價，將更有利于纖溶酶的開發利用。第二，需要從野生菌株中發現具有耐酸性、耐高溫以及對纖維蛋白有較強特異性等生物化學特性的纖溶酶，或通過基因工程和蛋白工程等方法在工程菌株中進行改進。第三，纖溶酶的生產成本很高，因此需要尋求更為經濟可行的方法，從而科學指導纖溶酶產業的升級，提高經濟效益。未來可考慮在其他不同領域深入研究，開發研究新型產品，通過技術革新，提高產品質量。