具有抑菌活性乳酸菌的分離、鑒定及其生長特性研究

張 甜，丁真真，劉艷全，徐明宜，王繼蓮*

（1.喀什大學 生命與地理科學學院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態重點實驗室，新疆 喀什 844000）

漿水、酸奶、馕均為中國傳統發酵食品，極具地方特色，廣受大眾喜愛。傳統發酵食品中含有多種微生物，包括乳酸菌[1]。乳酸菌作為一類通過發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌，是一種無孢子革蘭氏陽性細菌[2-3]，其具有促進機體生長發育，調節消化道內菌群平衡，進而改善胃腸道功能、提高食物消化率和生物效價、降低血清膽固醇、控制內毒素、抑制腸道內腐敗菌生長、加強機體免疫力等功能[4]。

乳酸菌發酵產生的代謝產物有有機酸、細菌素和其他具有抗菌活性的物質[5]，TODOROV S D等[6-8]從糖蜜中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可產生抗革蘭氏陰性菌的細菌素，對腐敗菌和食源性病原體的生長和繁殖有強烈的抑制作用。細菌素具有高效、無毒、無殘留、無耐藥性等特點，可以抑制多種細菌、真菌，食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準商用的細菌素有乳酸鏈球菌素（Nisin）和片球菌素（Pediocin）等[9]。目前，已有乳酸菌及其代謝產物在乳及乳制品、肉及肉制品、果蔬制品、水產品、蛋制品中的應用報道，其在食品保鮮中起到一定效果，可作為新型生物防腐劑被開發利用[10-14]。

食品來源的乳酸菌具有安全、無害等特點，本研究旨在從陜西及喀什地區傳統發酵食品中分離篩選具有良好抑菌作用的乳酸菌，對其發酵上清液的穩定性及其生長特性進行研究，并通過分子生物學技術對篩選菌株進行鑒定，為具有抑菌活性乳酸菌的研究和天然生物防腐劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

陜西西安農家漿水、喀什地區傳統發酵酸奶和發酵馕面團，無菌袋取樣后置于4 ℃冰箱備用。

指示菌菌種包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）：由喀什大學生命與地理科學學院提供。

1.1.2 試劑

氯化鈉、草酸、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市圣奧化學有限責任公司；核酸染料、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）裂解液：日本TaKaRa公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基、LB培養基和營養瓊脂培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

ZWY-2102C全溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SHELLABG112電熱恒溫培養箱：寧波市科技園區新江南儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LDZF-751-2立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；5910R高速冷凍離心機：深圳市科時達電子科技有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；TU-1950紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；E221生物顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；Mastercycler nexus PCR儀：德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；ZF-20D暗箱式紫外分析儀：河南省百年儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

參照黃慧福等[15]的方法，分別稱量10 g漿水、酸奶、面團溶于90 mL無菌水中，旋渦振蕩混勻，梯度稀釋，每個樣品均稀釋10個梯度（10-1～10-10）。分別吸取3種樣品的7個稀釋梯度（10-4～10-10）的樣液200 μL，涂布于MRS固體培養基上，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h[16]。隨機選取單菌落于MRS固體培養基進行平板交叉劃線，37 ℃培養24 h，重復5次得到純化菌株。將純化后的菌株接種于MRS液體培養基，甘油保藏備用。

1.3.2 抑菌試驗

（1）指示菌菌懸液的制備

以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌3種微生物作為指示菌，將斜面保藏的菌株接種到營養瓊脂培養基中，37 ℃條件下活化培養兩次。挑取單菌落接種到LB液體培養基中，37 ℃、150 r/min培養24 h，用0.85%的滅菌生理鹽水將指示菌濃度稀釋至108CFU/mL，得到指示菌菌懸液[17]。

（2）發酵上清液制備

將篩選純化的單菌落接種于MRS肉湯培養基中，37 ℃、120 r/min培養24 h，得到發酵液。發酵液于4 ℃、14 000 r/min離心10 min，得發酵上清液，置于4 ℃冰箱備用[18]。

（3）發酵產物抑菌活性的測定[19-22]

抑菌乳酸菌的篩選：吸取100 μL 3種指示菌菌懸液，分別涂布于營養瓊脂培養基上。將涂布好的培養皿劃分為四個區域，分區域放入滅菌牛津杯，再吸取200 μL各菌株的發酵上清液滴入牛津杯，37 ℃培養24 h，觀察是否產生抑菌圈。測量抑菌圈的直徑，篩選出抑菌圈較大的菌株。

發酵產物酸堿處理后的抑菌試驗：用1 mol/L的草酸溶液和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節發酵上清液的pH至2.0和9.0，其中一組保持2 h后再調回其初始pH，另一組保持pH至2.0和9.0，測量抑菌圈的直徑。

發酵產物熱處理后的抑菌試驗：分別將發酵上清液經60 ℃和100 ℃處理15 min，測量抑菌圈直徑。

1.3.3 篩選菌株的生長特性

生長曲線和產酸能力測定[19，23]：按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養基，37 ℃振蕩培養24 h，每隔2 h取樣，測定發酵液在波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）和pH，繪制生長曲線和pH變化曲線。

抑菌動力學試驗[19]：按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃振蕩培養24 h，每隔2 h取樣，測定其發酵上清液對指示菌的抑菌圈直徑，并繪制抑菌動力學曲線。

耐酸堿試驗[24-25]：用1 mol/L的草酸溶液和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節MRS液體培養基的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養基，37 ℃振蕩培養24 h后測定發酵液的OD600nm值。

耐滲透壓試驗[25]：按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養基中，分別添加氯化鈉含量至0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，37 ℃振蕩培養24 h，測定發酵液的OD600nm值。

1.3.4 篩選菌株的分子生物學鑒定

用滅菌牙簽挑取乳酸菌單菌落于50 μL裂解液中，充分混勻，90 ℃水浴裂解15 min得到脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，利用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對16S rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板2μL、引物各2μL、2×PowerTaqPCR MasterMix 25 μL、補充雙蒸水（ddH2O）至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存[26]。將PCR擴增產物送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序，返回的基因序列在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站的GenBank數據庫中與已知序列進行同源比對，利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）繪制系統發育樹[27]。

1.3.5 數據處理

每一組實驗平行測定3次，結果用“平均值±標準差”表示，采用SPSS Statistics 26.0對數據進行處理，采用單因素方差分析和Duncan多范圍檢驗確定數據之間的顯著性差異（P＜0.05），采用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

稀釋涂布后和交叉純化的菌落見圖1。由圖1可知，各菌落間形態差異較小，乳酸菌單菌落均呈乳白色圓球狀，其質地圓潤光滑，具有光澤。

圖1 部分乳酸菌的分離純化結果Fig.1 Isolation and purification results of some lactic acid bacteria

2.2 抑菌試驗結果

2.2.1 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

采用牛津杯法共篩選出15株具有抑菌能力的菌株，編號為Y1～Y15，結果見表1。由表1可知，所有菌株對大腸桿菌、普通變形桿菌和枯草芽孢桿菌這三種指示菌中的一種或多種具有抑菌能力，從中挑選出抑菌圈直徑＞13 mm且能夠同時抑制3種指示菌的4株菌株Y1、Y4、Y14和Y15進行進一步研究。

表1 篩選乳酸菌菌株發酵上清液的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of screened lactic acid bacteria supernatant

2.2.2 發酵產物經酸堿及高溫處理后的抑菌效果

發酵產物經酸堿、高溫處理后的抑菌效果見表2～表4。由表2～表4可知，4株菌株經高溫處理后抑菌圈直徑明顯減小，抑菌效果降低，且溫度越高，抑菌效果越弱。菌株Y1在60 ℃、100 ℃處理后對大腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活力保持在69%以上，但菌株Y4、Y14、Y15經100℃處理后對大腸桿菌的抑菌能力均消失，菌株Y4、Y14對普通變形桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活力保持在69%以上。

表2 不同條件下乳酸菌發酵上清液對大腸桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of lactic acid bacteria supernatant on Escherichia coli under different conditions

表3 不同條件下乳酸菌發酵上清液對普通變形桿菌的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of lactic acid bacteria supernatant on Proteus vulgaris under different conditions

表4 不同條件下乳酸菌發酵上清液對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of lactic acid bacteria supernatant on Bacillus subtilis under different conditions

大部分菌株發酵上清液經酸堿處理再調回原始pH后的抑菌效果明顯減弱，菌株Y1、Y14、Y15發酵上清液經酸堿處理后抑菌活力仍保持在67%以上，且除菌株Y15外，酸處理再調回后的抑菌效果小于堿處理再調回后的抑菌效果，尤其是菌株Y4，其經酸處理調回后對普通變形桿菌的抑菌活力消失，表明酸處理條件下會降低發酵液的抑菌活性。部分菌株經堿處理再調回后抑菌圈略有增大，可能是因為處理2 h后調回原始pH時添加的無機酸起到了抑菌效果。4株菌株發酵上清液pH調至2時抑菌圈明顯增大，表明調酸后添加的無機酸增加了抑菌效果，pH調至9時抑菌活性均較少甚至消失，可能是堿中和了發酵液中的有機酸，殘留部分細菌素起到的抑菌效果。

2.3 篩選菌株的生長特性

2.3.1 生長曲線和產酸能力

觀察篩選乳酸菌菌株在MRS肉湯培養基中培養24 h內的生長趨勢和產酸能力，結果見圖2。由圖2可知，4株菌株的生長曲線均呈“S”型，0～8 h為生長延滯期，菌體濃度不增長或增長緩慢；8～16 h為對數生長期，尤其8～12 h生長快速，此時細胞代謝非?；钴S；18 h后生長趨于穩定，OD600nm值穩定在2.4左右。隨著培養時間的延長，發酵液pH逐漸下降，培養20～24 h，菌株Y1的pH趨于3.5，菌株Y4、Y14、Y15的pH趨于2.5，說明4株菌株發酵后均能產酸，且菌株Y4、Y14、Y15的產酸能力高于菌株Y1。

圖2 4株篩選菌株的生長曲線和產酸曲線Fig.2 Growth and acid production curves of 4 screened strains

2.3.2 抑菌動力學曲線

對菌株Y1、Y4、Y14、Y15進行抑菌動力學試驗，結果見圖3。由圖3可知，發酵上清液在培養4 h時開始具有抑菌活性，在生長延滯期抑菌活性增加緩慢；在生長對數期時，抑菌活性增加較快；進入生長穩定期后抑菌活性基本穩定。根據Gaden的分批發酵產物動力學學說[28]，產物生成與菌體生長相關，即抑菌曲線和生長曲線呈現伴隨式生長，為生長偶聯型。

圖3 4株篩選菌株對大腸桿菌（A）、普通變形桿菌（B）及枯草芽孢桿菌（C）的抑菌動力學曲線Fig.3 Antibacterial kinetics curves of 4 screened strains against Escherichia coli (A), Proteus vulgaris (B) and Bacillus subtilis (C)

2.3.3 耐酸堿能力

對菌株Y1、Y4、Y14、Y15進行耐酸堿試驗，結果見圖4。由圖4可知，4株菌株的最適生長pH值為6.0。菌株Y1在pH 5.0～8.0時生長良好，在pH＜5.0和pH＞8.0時生長受到抑制。菌株Y4、Y14在pH 5.0～7.0、菌株Y15在pH 4.0～7.0時生長良好，菌株Y14和Y15在pH 4.0時的OD600nm值分別為0.800、1.802，高于菌株Y1（0.231）和Y4（0.190），菌株Y1和Y15在pH 8.0時的OD600nm值分別為1.387、0.769，高于菌株Y4（0.185）和Y14（0.148），說明菌株Y15、Y14的耐酸能力高于菌株Y1和Y4，菌株Y1、Y15的耐堿能力高于Y4和Y14。綜上，菌株Y15的耐酸較好，菌株Y1的耐堿性較好。

圖4 4株篩選菌株的耐酸堿能力Fig.4 Acid and alkali tolerance of 4 screened strains

2.3.4 耐滲透壓能力

對菌株Y1、Y4、Y14、Y15進行耐滲透壓試驗，結果見圖5。由圖5可知，菌株Y1、Y4、Y15在不添加NaCl時生長最好。隨著NaCl含量的增加，菌株的生長均受到不同程度的抑制。當NaCl含量為2%時，菌株Y14和Y15生長較好，OD600nm值分別為2.355、2.383；當NaCl含量為4%時，菌株Y14和Y15能生長，且菌株Y15的OD600nm值（1.430）高于菌株Y14（0.560），而菌株Y1和Y4幾乎不生長；當NaCl含量≥6%時，所有菌株幾乎不生長。綜上，菌株Y15的耐滲透壓能力最好。

圖5 4株篩選菌株的耐滲透壓能力Fig.5 Osmotic pressure tolerance of 4 screened strains

2.4 篩選菌株的鑒定

基于16S rDNA基因序列構建4株篩選菌株的系統發育樹，結果見圖6。由圖6可知，菌株Y1和Y4與發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）聚于一支，親緣關系最近；菌株Y14和Y15與植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）聚于一支，親緣關系最近。因此，鑒定菌株Y1和Y4為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），鑒定菌株Y14和Y15為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。

圖6 基于16S rDNA基因序列4株篩選菌株的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 4 screened strains based on 16S rDNA gene sequences

3 結論

本研究以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）為指示菌，采用傳統培養分離法結合牛津杯法從傳統發酵食品中篩選得到4株具有良好抑菌活性的乳酸菌菌株，分別為Y1、Y4、Y14和Y15。4株菌株的發酵上清液均能抑制3種指示菌的生長，其中，菌株Y1抑菌活性較好，對3種指示菌的抑菌圈直徑均達＞13 mm，其發酵上清液在60 ℃、100 ℃處理后的抑菌活力保持在69%以上；菌株Y1、Y14、Y15發酵上清液經酸堿處理后在調回抑菌活力仍保持在67%以上。4株菌株的生長曲線與產酸特性和抑菌活性存在生長偶聯相關性，進入穩定期后，抑菌圈直徑趨于穩定，可在發酵12～18 h時終止發酵。4株菌株均在pH 5.0～7.0時生長良好，最適生長pH均為6.0，其中菌株Y15耐酸性及耐滲透性較好，菌株Y1耐堿性較好。經分子生物學鑒定，菌株Y1和Y4為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株Y14和Y15為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。