乙醇降解乳酸菌的篩選、鑒定及解酒防醉功效評價

宋 佳，余 萍*，林欣梅，陳雪嬌，王婷婷，彭永振

（1.江西仁仁健康微生態科技有限公司，江西 樟樹 331200；2.仁仁微生物科技研究（沈陽）有限公司，遼寧 沈陽 110170）

過量飲酒或飲酒不當會引起嚴重的健康問題，全世界每年有300萬人死于過量飲酒，占所有死亡人數的5.3%[1-3]。乙醇進入人體后主要在小腸中吸收[4]，隨后穿過生物膜并分布到全身，在幾乎所有組織中進入檸檬酸循環[5]。大腦、心臟、胃腸道和肝臟等多個器官的200多種疾病都與習慣性飲酒有關[6]。在這些酒精損傷的器官中，肝臟是體內酒精代謝的主要部位，因此更易受到損傷。因乙醇造成的肝組織疾病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化和肝癌等[7-8]。

人們對如何解酒的探討也是長盛不衰，目前，有關解酒的研究主要圍繞中草藥、果蔬、糧油類、畜產類等原料及其制品進行[9-13]，如解酒功能成分分析（主要為多糖、多肽、黃酮、酶等）及解酒酵素、復方制劑、保健涼茶的研制等[12-13]。其解酒原理主要集中在影響乙醇代謝或抑制乙醇吸收方向，如基于乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）參與的氧化代謝途徑，通過加強乙醇的首過效應而達到解酒的目的[14]；或者基于保肝護肝的原理，通過代謝增強肝組織中超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）的活性，改善肝細胞的通透性等起到解酒護肝的作用[15]；或者減少、減慢胃和十二指腸對乙醇的吸收來實現解酒功能等[16]。這些醒酒方式雖具有一定解酒、醒酒功效，但也會伴隨著不同的副作用，對人體健康不利。對此，微生物制劑以能夠直接降解乙醇特點受到人們的廣泛關注，劉威良等[17]篩選得到1株乙醇耐受性強的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），其在體積分數為20%的乙醇條件下培養24 h后，乙醇含量降為10%左右；在體積分數為40%的乙醇條件下培養24 h后，乙醇含量降為15%左右。楊小柏[18]從黃水和窖泥中篩選得到1株降解乙醇能力較強的菌株，其降解乙醇速度達1.45mL/d。

為了進一步研究開發具有解酒功能的益生菌，本研究采用傳統培養分離法從傳統發酵食品奶疙瘩中分離乳酸菌，通過乙醇降解能力的測定篩選具有降解乙醇功能的菌株，并通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物技術對其進行菌種鑒定，同時，對其安全性及耐受性進行研究，并通過小鼠試驗研究該菌株對體內防醉和解酒的功效，為其解酒應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與動物

傳統發酵食品奶疙瘩樣品：內蒙古呼倫貝爾額爾古納市三河回族鄉，無菌操作取樣寄送至實驗室，并于-20 ℃條件保存備用。

60只健康昆明小鼠，年齡6周，體質量25～30 g，雌雄各1/2，購自遼寧長生生物技術有限公司，生產許可SCXK（遼）2020-0001。動物在抵達后用標準飲食喂養一周后進行試驗。環境溫度維持在25 ℃左右，相對濕度控制在50%左右，光暗12 h循環。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基[19]：酵母蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，酵母浸出物4 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，一水檸檬酸2 g/L，乙酸鈉5 g/L，無水葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，吐溫-80 0.6 g/L，番茄汁10 mL/L，調pH至6.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min；MRS固體培養基：MRS液體培養基中添加2%瓊脂。

改良的MRS固體培養基[19]：酵母蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，酵母浸出物4 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，一水檸檬酸2 g/L，乙酸鈉5 g/L，無水葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，吐溫-80 0.6 g/L，碳酸鈣10 g/L，中性紅0.05 g/L，番茄汁10 mL/L，瓊脂粉20 g/L，調pH至5.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

基礎培養基：酵母蛋白胨10 g/L，酵母浸出物5 g/L，無水葡萄糖20 g/L，一水檸檬酸2 g/L，L-蘋果酸3 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.01 g/L，pH 6.60。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

優化培養基：酵母蛋白胨10 g/L，酵母浸出物30 g/L，無水葡萄糖30 g/L，一水檸檬酸2 g/L，L-蘋果酸3 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.01 g/L，吐溫80 0.1 g/L，氯化鈣0.5 g/L，pH 6.60。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 試劑

無水葡萄糖、三氯乙酸、苯酚（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；濃硫酸、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；重鉻酸鉀（純度99%）：西隴科學股份有限公司。牛膽鹽（純度99.8%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）、胃蛋白酶（酶活12 000 U/g）：北京奧博星生物技術有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：生工生物工程（上海）股份有限公司；梅里埃21342革蘭氏陽性細菌鑒定卡VITEK GP及配套試劑：法國生物梅里埃股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-500BS恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器有限公司；LDZX-50KBS滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1D無菌操作臺：上海滬凈醫療器械有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；EPOCH2NSC-SN酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；UPT-II-20T純水儀：四川優普超純科技有限公司；C20-F3E電磁爐：格蘭仕生活電器制造有限公司；VITEK2 Compact全自動微生物分析系統：法國生物梅里埃股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 傳統奶疙瘩樣品中乳酸菌菌株的分離純化

取適量奶疙瘩樣品于MRS液體培養基中，37 ℃富集24 h。將富集后的樣品混勻，采用無菌水按10倍梯度稀釋，取不同梯度的稀釋液涂布于改良的MRS固體培養基上，37 ℃條件下培養48 h。挑取菌落呈球狀、細胞成對排列、無內生芽孢、革蘭氏陽性的單菌落進行多次分離純化，得到純化菌株，4 ℃保存備用。

1.3.2 高效降解乙醇功能菌株的篩選

將分離純化的菌株接種至5 mL MRS液體培養基中，37 ℃培養20 h后，取5 mL菌液接種至100 mL MRS液體培養基中，37 ℃培養17 h，作為種子液。

將分離菌株的種子液按5%的接種量接種于乙醇體積分數為10%的MRS液體培養基中，以乙醇體積分數為10%的MRS液體培養基為空白對照，37 ℃培養24 h。取培養好的菌液10 000 r/min離心10 min，取上清液，利用重鉻酸鉀-硫酸法測定乙醇含量，并計算乙醇降解率，分析各菌株的乙醇降解能力。乙醇降解率的計算公式如下：

式中：C0為空白對照中乙醇的體積分數，%；C為試驗組中乙醇的體積分數，%。

1.3.3 篩選菌株的乙醇耐受性分析

將分離菌株的種子液按2%的接種量接種于不同乙醇體積分數（4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液體培養基中，37 ℃進行乙醇脅迫12 h，同時以不含乙醇的MRS液體培養基培養組作為陰性對照，脅迫后采用紫外分光光度計在波長620 nm處測定OD620nm值，比較其生長狀況，并計算存活率，其計算公式如下：

式中：A1為含乙醇的MRS培養基培養12 h后的OD620nm值；A0為不含乙醇的MRS培養基培養12 h后的OD620nm值。

1.3.4 篩選菌株的鑒定

形態學觀察：將篩選菌株接種至MRS固體培養基，37 ℃培養48 h，觀察菌株形態。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在生物顯微鏡下觀察細胞形態。

生理生化鑒定：利用梅里埃21342革蘭氏陽性細菌鑒定卡VITEK GP和VITEK2 Compact全自動微生物分析系統對篩選菌株進行生理生化鑒定。

分子生物學鑒定：參照文獻[20]對篩選菌株進行分子生物學鑒定。

1.3.5 篩選菌株的安全性評價

藥物敏感性試驗：參照CLSI M45-A3《不常見或苛養菌藥敏方法》（2015）標準執行。

溶血試驗：參照文獻[21]進行。

1.3.6 篩選菌株的耐酸及耐膽鹽試驗

耐酸及耐膽鹽試驗：將篩選菌株的種子液按10%的接種量分別接種于不同pH（2.0、3.0、6.5）及不同膽鹽含量（0、0.3%、0.5%、1.0%和1.5%）的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養，于培養0 h、1 h、2 h和4 h取樣，用滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液1 mL接種于MRS固體培養基，37 ℃靜置培養36 h后進行菌落計數[22]。

耐酸及耐膽鹽延遲時間測定：將篩選菌株的種子液按10%的接種量分別接種于不同pH（2.0、3.0、6.5）及不同膽鹽含量（0、0.3%、0.5%、1.0%和1.5%）的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養。其中耐酸延遲時間試驗在培養2 h后，按照10%的接種量轉接在pH 6.5的MRS液體培養基中繼續培養，耐膽鹽延遲時間試驗不進行轉接。每隔30 min取樣測定OD620nm值，直到OD620nm值增長0.3個單位時，停止測定。計算菌株在酸性/含膽鹽培養基中與在pH6.5/膽鹽含量0%的培養基中OD620nm值增加0.3個單位所需的時間，二者之差被稱為延遲時間[22]。

1.3.7 篩選菌株耐胃液試驗

人工模擬胃液的配制[22]：取稀鹽酸16.4 mL，加蒸餾水800mL，加入胃蛋白酶10g，搖勻后用蒸餾水定容至1000mL，調節pH值至2.0，0.22 μm有機濾膜過濾除菌。

取菌懸液10 mL離心（5 000×g，10 min，4 ℃）獲得菌泥，用PBS沖洗2次，獲得的菌泥重懸于10 mL人工模擬胃液中，37 ℃條件下消化3 h，分別于0 h、3 h取樣，用滅菌的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取適宜稀釋度的菌液1 mL涂布于MRS固體培養基，37 ℃靜置培養36 h后，進行菌落計數。

1.3.8 篩選菌株防醉和醒酒能力體內試驗

按照10%的接種量將凍存管中復蘇的菌體轉接到10mL基礎培養基中，37 ℃靜置培養17 h，獲得菌懸液。將該菌懸液轉接到100 mL基礎培養基中，37 ℃靜置培養17 h。然后將該菌懸液以3%的接種量接種到200 mL優化培養基中，37 ℃靜置培養17 h。培養結束后將其稀釋為活菌數分別為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL的菌懸液，備用。

參考文獻[23]，將60只小鼠隨機分為10組，解酒試驗和防醉試驗各5組，每組6只，雌雄各占50%。根據常見市售白酒的酒精度，本試驗小鼠在禁食12 h后，各組灌胃10 mL/kg體質量（body mass，bm）體積分數為50%的乙醇以建立醉酒模型。乙醇灌胃30 min前（防醉試驗）及5 min后（解酒試驗），陰性對照組（NC）灌胃10 mL/kg bm生理鹽水，陽性對照組（PC）灌胃10 mL/kg bw美他多辛（約500 mg/kg bm），低（L）、中（M）、高（H）劑量組灌胃10 mL/kg bm菌懸液，活菌數分別為1×107CFU/mL、1×108CFU/mL、1×109CFU/mL。記錄5組小鼠翻正反射消失時間和翻正反射恢復時間，翻正反射消失時間的標準為小鼠仰臥保持30 s，否則認為翻正反射恢復。計算醉酒潛伏期（灌酒到翻正反射消失時間）、醒酒時間（翻正反射消失到翻正反射恢復時間）。

1.3.9 數據處理

每個試驗重復3次平行測定，試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，并利用Duncan's法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離及高效降解乙醇菌株的篩選結果

采用傳統培養分離法從奶疙瘩樣品中共分離得到12株疑似乳酸菌菌株，其乙醇降解能力見圖1。

圖1 分離菌株的乙醇降解能力Fig.1 Ethanol degradation abilities of isolated strains

由圖1A可知，所有菌株均具有乙醇降解能力，乙醇降解率為1.15%～13.38%，其中，菌株RH2712的乙醇降解率最高為13.38%。因此，將菌株RH2712作為高效降解乙醇的目標菌株。

2.2 菌株RH2712的乙醇耐受性

菌株RH2712的乙醇耐受性試驗結果見見圖2。由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增加，菌株RH2712存活率逐漸下降，當乙醇體積分數為10%時，菌株RH2712的存活率為45.34%；當乙醇體積分數為12%時，菌株RH2712的存活率仍可達34.20%，說明菌株RH2712具有較好的乙醇耐受性，可耐受體積分數為12%的乙醇。

圖2 菌株RH2712的乙醇耐受性Fig.2 Ethanol tolerance of strain RH2712

2.3 菌株RH2712的鑒定

2.3.1 形態觀察

菌株RH2712的菌落及細胞形態見圖3。由圖3可知，菌株RH2712的菌落為白色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣整齊；細胞呈球狀，直徑為0.7～1.0 μm，單個或成對排列，革蘭氏染色為陽性。

圖3 菌株RH2712的菌落（A）及細胞（B）形態Fig.3 Colony (A) and cell (B) morphology of strain RH2712

2.3.2 生理生化鑒定

菌株RH2712的生理生化鑒定結果見表1。由表1可知，D-苦杏仁甙、β-半乳糖苷酶、水楊素、磷脂酰酯酶C、α-葡糖苷酶、支鏈淀粉等29項結果呈陰性，亮氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶、L-乳酸鹽堿化、桿菌肽耐受等14項結果呈陽性。根據VITEK2 Compact全自動微生物分析系統中的GP結果，初步鑒定該菌株為片球菌屬（Pediococcussp.）。

表1 菌株RH2712的生理生化試驗結果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of strain RH2712

2.3.3 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構建菌株RH2712的系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株RH2712與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）DSM 20284T在一個分支上，親緣關系最近。結合形態、生理生化鑒定結果，最終鑒定菌株RH2712為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

圖4 基于16S rDNA基因序列菌株RH2712的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain RH2712 based 16S rDNA gene sequences

2.4 乳酸片球菌RH2712的安全性評價結果

乳酸片球菌RH2712耐藥性實驗結果見表2，溶血試驗結果見圖5。

表2 乳酸片球菌RH2712最小抑菌濃度值及藥敏性Table 2 Minimal inhibitory concentration and drug sensitivity of Pediococcus acidilactici RH2712

圖5 乳酸片球菌RH2712的溶血性實驗的結果Fig.5 Hemolysis test results of Pediococcus acidilactici RH2712

由表2可知，乳酸片球菌RH2712對氨芐西林、青霉素、亞胺培南、氯霉素敏感，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值分別為2 μg/mL、1 μg/mL、0.125 μg/mL和4 μg/mL。由圖5可知，陽性對照菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC 10473出現明顯的透明圈，表現為溶血，乳酸片球菌RH2712與陰性對照菌英諾克李斯特氏菌（Listeria innocua）CICC 10417結果一致，均無透明圈，說明乳酸片球菌RH2712溶血性安全，可作為安全益生菌使用。

2.5 乳酸片球菌RH2712耐逆性試驗結果

乳酸片球菌RH2712的耐逆性試驗結果見圖6。

圖6 乳酸片球菌RH2712耐逆性試驗結果Fig.6 Stress tolerance test results of Pediococcus acidilactici RH2712

由圖6A和6B可知，乳酸片球菌RH2712在pH 6.5的條件下活菌數對數值隨著培養時間的延長而增加；在pH 3.0的條件下活菌數對數值無明顯變化，延遲時間為2 h；在pH 2.0的條件下活菌數對數值降低，延遲時間為2.15 h。由圖6C可知，在不同膽鹽含量條件下，活菌對數值隨培養時間的延長均呈現先下降后上升的趨勢，0.3%、0.5%和1.0%膽鹽含量下延遲時間均為0 h。即使膽鹽含量達到1.5%，培養4 h后活菌對數值也達到8.72，延遲時間也只有0.5 h。由圖6D可知，乳酸片球菌RH2712在人工模擬胃液條件下，0 h的活菌對數值為9.19，經3 h處理后活菌對數值也達到7.14。

通常情況下人在空腹狀態時的胃酸pH約在0.9～1.5，飯后胃液被稀釋，pH也在3.5左右[24]。當益生菌進入人體后，胃酸會導致其活力下降[25]，而乳酸片球菌RH2712在模擬胃液條件下經3 h處理后活菌數對數值仍能達到7.14，表明其能順利通過胃進入腸道。乙醇的主要吸收部位在小腸，小腸中膽鹽含量一般在0.03%～0.30%之間，高含量的膽鹽會抑制益生菌的生長和定植[26-28]，本研究中即使膽鹽含量達到1.5%時培養4 h后活菌對數值也能達到8.72，表明乳酸片球菌RH2712能夠順利進入并定植于小腸中。延遲時間代表菌株在逆環境下受到影響的大小，乳酸片球菌RH2712無論在酸還是膽鹽的脅迫下延遲時間都在可接受范圍內，表明該菌株還具有良好的耐酸耐膽鹽能力，滿足益生菌生理功能正常發揮的要求。

2.6 乳酸片球菌RH2712防醉和醒酒能力體內實驗結果

通過灌胃乙醇建立小鼠醉酒模型進一步驗證乳酸片球菌RH2712的解酒防醉的效果，結果表明，所有組小鼠都出現了不同程度的醉酒癥狀，且無雌雄差異。乳酸片球菌RH2712對小鼠醉酒潛伏期和醒酒時間的影響見圖7。由圖7可知，與陰性對照組相比，其他組小鼠醉酒潛伏期顯著增加（P＜0.05），醒酒時間顯著降低（P＜0.05）。

圖7 乳酸片球菌RH2712對小鼠醉酒潛伏期（A）和醒酒時間（B）的影響Fig.7 Effects of Pediococcus acidilactici RH2712 on drunken latency(A) and sober up time (B) in mice

由圖7A可知，在解酒試驗中，與陽性對照組相比，中、高劑量乳酸片球菌RH2712組的醉酒潛伏期顯著增加（P＜0.05）；低劑量乳酸片球菌RH2712組的醉酒潛伏期無顯著差異（P＞0.05）。在防醉試驗中，高劑量乳酸片球菌RH2712組的醉酒潛伏期與陽性對照組無顯著差異（P＞0.05）。由圖7B可知，在解酒試驗中，高劑量乳酸片球菌RH2712組醒酒時間顯著低于陽性對照組（P＜0.05），而在防醉試驗中陽性對照組效果最佳。此外，無論是從醉酒潛伏期還是醒酒時間來看，乳酸片球菌RH2712的解酒能力顯著強于防醉能力（P＜0.05）。

本研究所用的陽性對照美他多辛（哆醇L-2-吡咯烷酮-5-羧酸鹽）是一種常見的解酒藥，能夠增加細胞中乙醇和乙醛脫氫酶的活性，加快血漿中乙醇和乙醛的消除[29]。與美他多辛相比，中、高劑量乳酸片球菌RH2712的解酒功能更強，低劑量時效果也與之相似。而在防醉試驗中，只有高劑量乳酸片球菌RH2712醉酒潛伏期達到美他多辛的效果。說明該菌株更適合在飲酒后立即服用，這可能是因為飲酒后胃酸被稀釋，使胃中pH升高，從而更適合菌株的生長。

3 結論

本研究從傳統發酵食品奶疙瘩中分離篩選出一株乙醇降解率為13.38%、可耐受體積分數12%乙醇的菌株RH2712，經形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。該菌株對氨芐西林、青霉素、亞胺培南、氯霉素敏感，MIC值分別為2 μg/mL、1 μg/mL、0.125 μg/mL和4 μg/mL，溶血性安全，可作為安全益生菌使用。該菌株具有良好的耐酸、耐膽鹽能力，在pH 3.0的條件下活菌對數值幾乎不變，延遲時間為2 h；在1.5%膽鹽含量下培養4 h后活菌對數值達到8.72，延遲時間僅為0.5 h；在人工模擬胃液條件下處理3 h后活菌對數值仍能達到7.14。乳酸片球菌RH2712在小鼠試驗中表現出明顯的防醉解酒的功效，且活菌數為1×108～1×109CFU/mL時解酒功能強于美他多辛。本研究為益生菌在急性酒精中毒上的應用提供了依據，未來市場前景廣闊。