泡盛曲霉固態發酵產阿魏酸酯酶條件優化

張 婷，劉喜瑩，陳 濤*

（華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

阿魏酸（ferulic acid，FA）全稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，廣泛存在于麩皮、米糠、咖啡、甜菜粕、谷殼等食品原料及副產物中，是一種天然的植物酚酸類物質[1-2]。阿魏酸具有抗氧化[3-5]、抑菌消炎[6-7]、降血脂[8]、抗腫瘤抗癌[9-10]等良好的生理保健功能，是公認的天然抗氧化劑。在國際上，一些國家已批準將其作為食品添加劑應用于食品[11-12]。但阿魏酸在植物細胞壁中通常以酯鍵或醚鍵形式與細胞壁多糖、木質素交聯，多為結合態，無法發揮出最佳生理活性[13]。制備游離態阿魏酸的方法主要有直接從植物中提取、化學合成法以及生物合成法三類，相比堿水解法、化學法，微生物發酵法生產成本更低且綠色環保。

阿魏酸酯酶（feruloyl esterase，FAE）（E.C.3.1.1.73）屬羧酸酯水解酶亞類，能高效降解植物細胞壁，水解斷裂羥基化肉桂酸與多糖之間交聯酯鍵，釋放生物活性成分—游離態阿魏酸及其衍生物[14]。自然界中，包括細菌、真菌和酵母在內的超過30種微生物均能分泌阿魏酸酯酶，大多數為絲狀真菌[15]，如黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、宇佐美曲霉（Aspergillus usamil）等。真菌中以黑曲霉研究居多[16-17]，主要通過微生物固態發酵分泌表達FAE。趙浩源等[18]以麥麩和甘蔗渣質量比2∶1混合作為基質，采用黑曲霉在30 ℃發酵7 d，阿魏酸酯酶活力最高為8.2 U/g；李松等[19]篩選出一株土曲霉（Aspergillus terreus），通過優化液態發酵條件，阿魏酸酯酶酶活達205 U/L；SHIN H Y等[20]研究發現，利用泡盛曲霉或米曲霉固態發酵黑米糠，可以提高黑米糠醇提物的抗氧化活性，其中原兒茶酸和阿魏酸含量顯著增加；方園等[21]將泡盛曲霉接種在以麩皮和蔗渣為固態發酵底物的培養基中，通過培養基成分優化，得到最高FAE酶活達0.067 9 U/g。隨著阿魏酸酯酶不斷擴大應用范圍，更多學者致力于尋求能產阿魏酸酯酶的優良菌株，但目前優化泡盛曲霉發酵產阿魏酸酯酶工藝的研究較少。

本研究以泡盛曲霉（Aspergillusawamori）CGMCC3.2576為研究對象，以FAE酶活性為響應值，利用單因素試驗結合響應面法對該菌種發酵產FAE的條件進行優化，得出最佳產酶條件，以期進一步提高阿魏酸酯酶活性，為阿魏酸酯酶有效釋放產品中阿魏酸提供參考和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種泡盛曲霉（Aspergillus awamori）CGMCC3.2576：中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘油、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；淀粉酶（10 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

初始固態發酵培養基[22]：麩皮與水按1∶1（g∶mL）混合，250 mL錐形瓶中裝量10 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

查氏培養基[23]：蔗糖30 g，NaNO33 g，KCl 0.5 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SPL-250生化培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；UV-2600紫外分光光度計：日本Shimadzu公司；Heal Force臺式高速冷凍離心機：力康生物醫療科技控股有限公司；高壓滅菌器GI54DWS：武漢遞熱愛生物科技有限公司；VD-1320型潔凈工作臺：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡盛曲霉CGMCC3.2576的固態發酵

取已經培養好的斜面試管一支，加入5 mL無菌水，將表面的泡盛曲霉CGMCC3.2576孢子刮下，放入預先裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩0.5 h，將孢子懸液打散，過濾得孢子懸液，調節孢子懸液濃度為107～108個/mL。將泡盛曲霉CGMCC3.2576孢子懸液按2%的接種量接種至初始固態發酵培養基，28 ℃培養5 d。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活性的測定

酶解底物的制備[24]：取100 g新鮮麥麩于燒杯中，加入1 000 mL 60～70 ℃熱水，pH 5.5～7.7之間，攪拌均勻，加入0.3%淀粉酶，55 ℃水浴加熱30 min，pH值調至中性，加入0.3%的中性蛋白酶，40 ℃水浴加熱45 min，沸水浴滅酶，干燥粉碎。

粗酶液的制備[25]：向發酵后的麩皮培養基中加入90 mL去離子水，28 ℃浸提1 h后過濾，濾液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集發酵上清液即為粗酶液，4 ℃儲存。

酶活性的測定[26]：取0.5 mL粗酶液，加入pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液至反應體系為10 mL，加入0.2 g酶解底物，40 ℃恒溫反應15 min，沸水浴滅酶，離心收集上清液。按上清液與無水乙醇體積比1∶4加入無水乙醇，混勻后離心，測定上清液在波長320 nm處吸光度值。以不接種微生物的發酵培養基提取液替代粗酶液為空白對照，計算酶活。

阿魏酸酯酶酶活性定義：在溫度50 ℃、pH6.0條件下，每分鐘水解阿魏酸乙酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量，定義為一個酶活力單位（mU/mL）。

1.3.3 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態發酵產阿魏酸酯酶條

件優化

（1）單因素試驗

采用單因素輪換法，在初始發酵條件的基礎上，依次考察發酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、碳源種類（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘油，10 g/L）及最佳碳源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L）、氮源種類（酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素，2 g/L）及最佳氮源添加量（2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L、12.0 g/L）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）對泡盛曲霉產阿魏酸酯酶的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選取發酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、酵母浸粉添加量（C）、接種量（D）四個因素為自變量，以阿魏酸酯酶酶活性（Y）為響應值，采用Design-Expert 13.0.1.0軟件設計4因素3水平的Box-Behnken響應面分析試驗，試驗設計因素與水平見表1。

表1 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態發酵產阿魏酸酯酶條件優化響應面試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for optimization of solid-state fermentation conditions for feruloyl esterase production by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

1.3.4 數據處理與統計分析

采用IBM SPSS Statistics 20進行顯著性分析，所有試驗均重復3次，結果以“平均值±標準差”表示；采用Origin 2019繪圖。

2 結果與分析

2.1 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態發酵產阿魏酸酯酶條件優化單因素試驗

2.1.1 發酵時間對阿魏酸酯酶活性的影響

發酵時間對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶活力的影響見圖1。

圖1 發酵時間對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，FAE活性呈先升高后下降的趨勢，當發酵時間為4 d時，FAE酶活性最高，為（1 496.60±56.64）mU/mL。分析原因可能是酶在發酵開始時產生緩慢，直到達到酶活力最高值，微生物代謝產物增加，阻礙發酵繼續進行，酶活性隨之降低[27]。因此，選擇最佳發酵時間為4 d。

2.1.2 碳源及葡萄糖添加量對阿魏酸酯酶活性的影響

不同碳源及葡萄糖添加量對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶活力的影響見圖2。

圖2 碳源種類（A）及葡萄糖添加量（B）對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.2 Effects of carbon source types (A) and glucose addition (B)on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

細胞合成和分泌酶受到多種因素調控，其中發酵底物是提高菌種產酶量的關鍵[28]。由圖2A可知，在葡萄糖作為唯一添加碳源時，FAE酶活性最高，達到（2 554.80±111.13）mU/mL，其次是蔗糖，FAE酶活為（2 261.53±30.23）mU/mL。因此，確定最佳碳源為葡萄糖。

由圖2B可知，隨著葡萄糖添加量的升高，FAE酶活性呈現先升高后下降的趨勢，可能是葡萄糖添加量較低時，發酵培養基中營養物質含量低，微生物生長受到限制；而當葡萄糖添加量過多，培養基營養物質濃度過高，微生物菌體生長被抑制[29]。當葡萄糖添加量為15 g/L時，FAE酶活性最高為（2 666.67±71.99）mU/mL。因此，選擇葡萄糖的最佳添加量為15 g/L。

2.1.3 氮源及酵母浸粉添加量對阿魏酸酯酶活性的影響

不同氮源及酵母浸粉添加量對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶活力的影響見圖3。

圖3 氮源種類（A）及酵母浸粉添加量（B）對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.3 Effects of nitrogen source types (A) and yeast extract powder addition (B) on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

阿魏酸酯酶等微生物分泌的酶系，其本質上是蛋白質，而菌體分泌蛋白質的關鍵營養因素是氮源[30]。由圖3A可知，采用酵母浸粉為唯一氮源時，FAE酶活性最高，達（3 368.10±37.89）mU/mL，其次為蛋白胨，FAE酶活為（2 923.66±21.80）mU/mL。分析原因可能是酵母浸粉作為蛋白質類原料的水解產物，含有多種易被微生物所利用的含氮有機化合物及核苷酸等微量元素，促進微生物生長和產酶[31]。因此，確定最佳氮源為酵母浸粉。

由圖3B可知，隨著酵母浸粉添加量逐漸增加，FAE活性呈現先上升后降低的趨勢。當酵母浸粉添加量為4 g/L時，FAE活性最高，為（3 383.22±23.99）mU/mL。因此，選擇酵母浸粉的最佳添加量為4 g/L。

2.1.4 泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量對阿魏酸酯酶活性的影響

微生物發酵產酶活性不僅與產酶菌種優良的生長條件及營養條件有關，控制發酵條件也十分必要。泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量對阿魏酸酯酶活性的影響見圖4。

圖4 泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量對產阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.4 Effect of Aspergillus awamori CGMCC3.2576 inoculum on feruloyl esterase activities

由圖4可知，隨著接種量的升高，阿魏酸酯酶活力呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是，接種量影響微生物在培養基中發酵速度和產酶效率，接種量過低時，固態發酵培養基中碳源、氮源等營養物質充足，菌株可以快速生長增殖并發酵分泌更多所需酶；但接種量過高，營養物質匱乏，菌株生長受到抑制，進而導致酶的分泌量減少。當泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量為10%時，FAE活性最高，為（3 879.06±34.07）mU/mL。因此，選擇最佳接種量為10%。

2.2 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態發酵產阿魏酸酯酶條件優化Box-Behnken響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選取發酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、酵母浸粉添加量（C）、接種量（D）4個因素為自變量，以阿魏酸酯酶活性（Y）為響應值，采用Design-Expert 13.0.1.0軟件設計4因素3水平的Box-Behnken響應面分析試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Benhnken響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert 13.0.1.0軟件對表2數據進行多元線性回歸分析，得到二次多項式方程為：Y=3 820.41-61.22A-154.95B-86.92C-112.62D-52.15AB-174.60AC-43.08AD-201.81BC-138.32BD-43.08CD-502.42A2-423.05B2-400.38C2-293.80D2。

由表3可知，模型F值=39.20，P值＜0.01，極顯著，失擬項P值=0.230 5＞0.05，不顯著，表明模型具有良好的擬合度，能與數據較好擬合。在回歸模型中，決定系數R2=0.975 1，調整決定系數R2Adj=0.950 3，說明該模型可以解釋95.03%的FAE酶活性變化，表明該模型建立成功，并可以利用該模型對泡盛曲霉產酶進行理論分析及預測。由表3亦可知，各因素對泡盛曲霉CGMCC3.2576產FAE活性的影響大小依次為：葡萄糖添加量＞微生物接種量＞酵母浸粉添加量＞發酵時間。一次項B、C、D，交互項AC、BC、BD及二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

通過Design-Expert 13.0.1.0軟件繪制AC、BC、BD間交互作用對FAE酶活性影響的響應曲面及等高線，結果見圖5。

圖5 各因素間交互作用對泡盛曲霉CGMCC3.2576產阿魏酸酯酶酶活性影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

由圖5可知，響應面均呈凸面，存在最大值，且等高下均呈橢圓形，說明各因素間交互作用對泡盛曲霉固態發酵麩皮產FAE酶活力影響較大，與方差分析結果一致。

利用Design-Expert 13.0.1.0軟件對回歸方程進行求解，得到最優發酵工藝為：發酵時間3.96 d，葡萄糖添加量14.28 g/L，酵母浸粉3.88 g/L，接種量9.69%。該方程模擬預測的阿魏酸酯酶活性為3 843.57 mU/mL。為便于實際操作，將最優產酶條件修正為發酵時間4d，葡萄糖添加量14.28g/L，酵母浸粉3.88g/L，接種量9.70%。在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到阿魏酸酯酶活性實際值為（3 912.32±34.34）mU/mL，與預測值相差1.75%，說明該模型適用于泡盛曲霉CGMCC 3.2576固態發酵產FAE酶活性工藝條件優化。

3 結論

本研究采用單因素試驗及響應面試驗，確定泡盛曲霉CGMCC3.2576發酵產FAE的最優條件為：發酵時間4 d，葡萄糖添加量14.28 g/L，酵母浸粉3.88 g/L，接種量9.70%。在此條件下，阿魏酸酯酶活性為3 912.32 mU/mL，為優化前的1.89倍。