響應面優化酸法提取沃柑皮果膠工藝

朱芙蓉，劉韋清，毛德源，王霜秀，韋 澳，韋志福，黃春蘭，張 婷*

（1.南寧學院 食品與質量工程學院，廣西 南寧 541699；2.廣西冰客食品有限公司，廣西 南寧 530100）

沃柑是由以色列太高將“坦普爾”橘橙與“丹西紅橘”雜交得到的新品種柑橘，屬于柑橘中的一種[1]。2012年，廣西武鳴雙橋鎮引進沃柑種植，與引進的茂谷柑相比，廣西沃柑具有個頭大、產量高、口感脆甜、破碎度高、含糖量高、酸度低等優良特性，深受消費者青睞。廣西沃柑種植面積已超過11.33萬hm2，產值高達100億元。但國內尚未形成深加工綜合利用沃柑皮的產業鏈，在加工過程中會產生大量的廢棄果皮通常被丟棄或填埋，給生態環境造成極大壓力[2]。研究發現，商業柑橘皮中果膠含量為30%～35%，可通過利用沃柑皮提取果膠增加沃柑整體資源利用價值，減少環境污染，同時為果膠生產提供新的原料基礎。盡管沃柑皮果膠具有很高的潛力，但對其提取工藝和理化特性的研究仍然相對較少。

果膠作為一種含有半乳糖醛酸的天然多糖聚合物，以原果膠、果膠、果膠酸的形式大量分布在植物的根、莖、葉及果實中，是高等植物細胞壁結構組成的重要成分[3-4]。不同植物組織利用常規提取方法提取的果膠含量由高到低依次為柑橘、甜菜、香蕉、仙人果、山楂、蘋果和獼猴桃[5]。楊宇華等[3]采用超聲法輔助乙醇提取沃柑皮果膠，但并沒有對果膠的理化特性進行進一步的研究。而就加工性能而言，果膠在食品工業中廣泛用作乳化劑、增稠劑和穩定劑在果醬和果凍等食品中，添加果膠可以增加其保水能力，增加黏度，提高凝膠強度[6-7]。

高溫和酸性環境促進不溶性原果膠的溶解，提高果膠得率，可以通過硝酸、鹽酸或硫酸等無機酸提取等方法提取[8]。不同種類酸提取的柑橘果膠得率差異顯著，其中磷酸的得率（10.82%）最低，硫酸的得率（11.97%）次之，硝酸的得率（12.65%）稍大，但其果膠顏色較暗黃[9]。張軍等[10]采用鹽酸法和磷酸氫二鈉法比較甘薯渣果膠提取效果，結果發現采用鹽酸提取果膠得率高達22.80%，而采用磷酸氫二鈉提取果膠得率為21.10%，鹽酸的提取效果更好。從實際制造的成本和效率的角度來看，酸提取果膠的主要優點是果膠產量高，提取時間短，因此酸提取和醇沉淀通常用于在商業基礎上提取果膠[11]。提取過程中，果膠產量和質量易受提取pH值、提取溫度、提取時間和比等因素的影響。本研究采用酸法提取沃柑果膠，并以果膠得率為指標，使用單因素響應面法進一步優化提取參數，隨后探討從沃柑皮中提取的果膠的理化性質的影響。旨在為沃柑副產物的高值化綜合利用提供理論依據，拓展酸法在果膠高效提取中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮沃柑（七八分熟）：南寧市武鳴區雙橋鎮市售；體積分數95%乙醇、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；D-半乳糖醛酸標準品（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

S220型pH計：梅勒特-托利多（中國）有限公司；SUB Aqua Pro型數顯恒溫水浴鍋：德國海蒂詩科學儀器公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司；SHZ-11型循環水真空泵：上海賢德實驗儀器有限公司；FD1007N型分析天平：上海精密科學儀器廠；TG16-WS高速離心機：湖南湘立科學儀器儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 沃柑皮果膠提取

沃柑預處理：取新鮮沃柑剝皮放入清水漂洗3次，瀝干水分后浸沒于沸水中漂燙滅酶10 min，隨后取出清水沖洗后放入烘箱干燥至質量恒定。取出干燥后的沃柑果皮用粉碎機粉碎，再過60目篩得到沃柑皮粉末，備用。

果膠的提?。簠⒖糓OORTHY I G等[12-13]的試驗略微修改。稱取1.000 g預處理樣品（沃柑皮粉末）加入一定體積的蒸餾水和稀鹽酸，將pH值調至酸性，水浴加熱使之充分發生水解反應。隨后置于12 000 r/min離心機中離心20 min，取上清液，加入2倍體積的體積分數95%乙醇來沉淀充分混勻，靜置1 h。用水循環真空泵抽濾，收集濾紙上的粗果膠并置于55 ℃恒溫干燥箱中烘干至質量恒定獲得干果膠。

1.3.2 果膠得率的計算

果膠得率的計算公式如下：

1.3.3 單因素試驗設計

精確稱取3份沃柑皮粉末，每份1.000 0 g，按照1.3.1中的果膠提取方法分別考察液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）（mL∶g）、提取pH值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）、提取溫度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃）、提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）對沃柑皮果膠得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

基于單因素試驗的結果，以果膠得率（Y）為響應值，以液料比（A）、提取pH（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）為主要影響因素，使用Design-Expert 13軟件進行4因素3水平的Box-Behnken試驗，并優化了通過酸提取法從沃柑皮中提取果膠的傳統工藝。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 果膠提取條件優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for extraction conditions optimization of pectin

1.3.5 沃柑果膠理化性質指標的測定

果膠水分含量：根據GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥法來測定；果膠酸不溶灰分：根據GB 25533—2010《食品安全國家標準食品添加劑果膠》[15]的方法進行測定。

1.3.6 沃柑果膠酯化度的測定

在李曉嬌等[16]的方法上稍加改進。精確稱取0.10 g果膠溶解于100 mL純凈蒸餾水中。加入2滴酚酞指示劑，使用0.10 mol/LNaOH溶液進行標定。當溶液變成粉色，并且顏色保持1 min不變時，記錄NaOH溶液的消耗量（V1，mL），作為初始滴定度。然后添加2.5 mL濃度為3.00 mol/L的NaOH溶液，混合均勻，并在5 min后加入2.5 mL濃度為3.00 mol/L的HCl溶液，振蕩直到溶液不再呈現粉色。最后，再加入2滴酚酞指示劑，用0.10 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液再次變成粉色，并保持1 min不變色，記錄NaOH溶液的消耗量（V2，mL）。沃柑果膠的酯化度計算公式如下：

1.3.7 沃柑果膠半乳糖醛酸含量的測定

D-半乳糖醛酸標準曲線制備：參考讓鳳菊等[17]的方法并稍加改進，將D-半乳糖醛酸溶液稀釋為10～90 μg/mL的9個不同梯度質量濃度的標準溶液。隨后依次取2 mL不同梯度濃度的半乳糖醛酸的標準溶液加入50 mL試管中，再加入12 mL濃硫酸，100 ℃加熱10 min后降至室溫，分別加入1 mL 0.15%咔唑溶液，室溫下避光靜置30 min，以蒸餾水做空白試驗。在波長530 nm處測定其吸光度值。以吸光度值作為縱坐標（y），半乳糖醛酸含量（x）為橫坐標繪制標準曲線，所得回歸方程為：y=0.059x+0.004 3，相關系數R2=0.993 7。根據標準曲線回歸方程計算樣品中果膠半乳糖醛酸的含量。

1.3.8 數據處理

所有的試驗都做3次平行，結果用“平均值±標準偏差”來表示。試驗得到的數據其響應面分析和試驗數據圖表的繪制用Origin 2021和Design-Expert 13軟件來進行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 液料比對果膠得率的影響

液料比對沃柑皮果膠得率的影響結果見圖1。

圖1 液料比對沃柑皮果膠得率的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on pectin yield of Orah peel

由圖1可知，液料比在10∶1～40∶1（mL∶g）之間，沃柑果膠得率隨著液料比的增大呈顯著上升趨勢（P＜0.05），液料比在40∶1（mL∶g）時，果膠得率最高，為21.53%，這主要是沃柑粉末與酸充分接觸，使果膠充分的擴散出來。液料比超過40∶1（mL∶g）時，得率下降，可能是由于溶解出來的果膠量逐漸達到飽和，過量的酸將原果膠轉化為水溶性果膠而分解[18]；料液比過小時，果膠沒有完全溶解于提取液中，物料粘性較大、在抽掉濾液取果膠時較困難，殘留增加，使果膠提取不完全，就會導致得率低[19]。因此，確定最佳提取液料比為40∶1（mL∶g）。

2.1.2 提取液pH對果膠得率的影響

液料比對沃柑皮果膠得率的影響結果見圖2。

圖2 提取pH對沃柑皮果膠得率的影響Fig.2 Effect of extraction pH on pectin yield of Orah peel

由圖2可知，提取pH值在1.0～1.5之間果膠得率呈現上升趨勢，提取pH值為1.5時，果膠提取效果最好，最大得率為22.17%，pH＞1.5時，果膠得率顯著下降（P＜0.05）。在酸性水解過程中，果膠通過消除水分子從纖維素中分離出來[20]。因此，當加入酸時，萃取系統中會產生更多的H+。H+越多越能將果膠從原果膠中分離出來并溶于水，可能是強酸的使用有利于沃柑皮中不可溶性原果膠轉化成可溶性果膠。pH值為1.0酸性過強時會導致水溶性果膠進一步脫酯裂解，從而使得率降低[21]；當提取pH值＞1.5時，果膠得率呈現明顯下降趨勢，特別是提取pH值為1.5～2.0時，得率呈現下降趨勢特別明顯，pH值較高時，一方面酸度減小，不能使原果膠完全轉化為水溶性果膠，果膠不穩定、開始降解，另一方面果膠物質水解不完全而且容易轉變為果膠酯酸，進而影響到果膠的得率[22]。因此，確定最佳提取pH為1.5。

2.1.3 提取溫度對果膠得率的影響

溫度在果膠的提取中起主要作用，提取溫度對沃柑皮果膠得率的影響見圖3。由圖3可知，提取溫度在60～80 ℃之間果膠得率隨溫度的升高呈上升趨勢，提取溫度為70～80 ℃之間，果膠得率隨溫度提高而顯著上升（P＜0.05），這是因為溫度升高通常會增加目標化合物的擴散系數，同時降低溶劑黏度。因此，溫度升高會增加傳質速率和溶劑向植物基質中的滲透[23-25]。提取溫度＞80 ℃時果膠得率從22.00%緩慢下降至19.03%。當提取溫度過低時，水解速度會比較慢并且水解不完全，果膠得率會比較低；溫度還會增加溶解度并加速植物組織的軟化，并削弱目標化合物與植物基質中其他化合物之間的相互作用，這使得更多的目標化合物能夠轉移到溶劑中。然而，提取溫度過高也可能導致果膠的降解、分解或解聚，果膠產品的均勻性差和果膠微觀結構的破壞，尤其是中性側鏈[26-28]。綜合考慮，選擇提取溫度80 ℃進行后續試驗。

圖3 提取溫度對沃柑皮果膠得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on pectin yield of Orah peel

2.1.4 提取時間對果膠得率的影響

提取時間對沃柑果膠得率的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著提取時間從30～90 min范圍內的增加，果膠的得率呈現出顯著上升的趨勢（P＜0.05），當提取時間為30～60 min時，由于提取時間較短，果膠可能未能被完全提取，導致得率較低。提取時間為90 min時，果膠得率最高，為20.13%，可能是沃柑皮粉與提取溶液接觸時間很合適，得到充分的反應，促使原果膠溶解。提取時間＞90 min時果膠得率呈下降趨勢，可能是由于酸對溶液中果膠作用的時間較長，部分果膠在酸作用下分解，促使部分雜質溶出，從而降低了果膠質量，以至果膠得率降低[28]。綜合考慮，選擇提取時間90 min進行后續試驗。

圖4 提取時間對沃柑果膠得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on pectin yield of Orah peel

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗結果

基于單因素試驗結果的分析，選擇對果膠得率影響較大的因素：液料比（A）、提取pH（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）為考察因子，以沃柑果皮果膠得率（Y）為響應值進行4因素3水平的Box-Behnken響應面試驗，試驗設計和結果見表2。

表2 果膠提取條件優化Box-Behnken試驗設計結果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments for extraction conditions optimization of pectin

利用Design-Expert 13軟件，對表2響應面試驗得到的數據結果進行多元回歸擬合，以優化主要影響因素，對擬合條件進行精細的分析，得到提取沃柑皮果膠的回歸方程如下：

2.2.2 回歸模型方差分析

沃柑皮果膠得率的響應面擬合回歸方程的方差分析結果見表3。由表3可知，模型F檢驗結果為64.52（P＜0.01），表明回歸模型達到極顯著水平。失擬項P=0.445 9＞0.05，不顯著。模型的變異系數（coefficient of variation，CV）為6.75%，決定系數R2=0.986 9，調整決定系數R2adj=0.971 6，表明擬合度很好，具有較好的可信度。R2adj與R2相近，說明回歸模型對從沃柑皮中提取果膠的實際值和預測值之間具有良好的總體一致性，因此，該模型可用于分析和預測沃柑皮果膠的最佳提取條件。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

由P值可知，提取pH值和提取溫度對果膠得率有極顯著影響（P＜0.01），提取時間對果膠得率有顯著影響（P＜0.05）。液料比和提取pH值的相互作用對果膠得率有顯著影響（P＜0.05），而液料比和提取溫度、液料比和提取時間、提取pH值和提取溫度、提取pH值和提取時間、提取溫度與提取時間的交互作用對果膠得率的影響不顯著（P＞0.05）。A2、B2、C2、D2對果膠得率有極顯著影響（P＜0.01）。

2.2.3 響應面分析

經過Design-Expert 13軟件對響應面的試驗數據進行處理，進一步分析影響沃柑皮果膠提取中每個因素的復雜性和作用。等高線圖和三維響應曲面圖提供了自變量之間相互作用強度的變化趨勢，并考察了液料比（A）、提取pH值（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）各因素交互作用影響，結果見圖5。

圖5 各因素間交互作用對沃柑皮果膠得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on pectin yields of Orah peel

由圖5可知，提取pH與液料比交互作用對果膠得率影響的3D響應曲面越陡峭，等高線圖為橢圓形，說明交互作用對果膠得率影響顯著，但影響不顯著。提取pH與提取溫度交互作用對果膠得率的等高線圖為扁平橢圓形，說明交互作用對果膠得率有一定影響，但影響不顯著。液料比與提取溫度、液料比與提取時間、提取pH值與提取時間以及提取溫度與提取時間兩兩交互作用的等高線圖均接近圓形；當一個變量固定時，果膠得率隨另一個變量的增加先升高后降低，3D曲面圖變化平緩，表明對果膠得率影響不顯著。各因素交互作用對沃柑皮果膠提取的影響程度，由大到小的順序為：AB＞BC＞AC＞BD＞CD＞AD。

2.2.4 驗證試驗

根據Design-Expert 13軟件處理沃柑果膠的數據得出其最佳的提取條件：液料比為50∶1（mL∶g）、提取pH為1.26、提取溫度為89.19 ℃、提取時間為97.18 min。在此條件下，沃柑果膠得率理論上可以達到21.96%?？紤]到試驗實際操作可行性，將提取工藝參數調整為液料比為50∶1（mL∶g）、提取pH值為1.3、提取溫度89 ℃、提取時間為97 min，將調整好的工藝參數進行3組平行驗證試驗，果膠得率分別為：21.4%、21.2%、21.5%，取其平均值為21.36%，與預測值接近，誤差為0.595。結果表明，使用響應面法對沃柑果皮果膠酸提取法提取的各因素進行優化研究是合理可行的，該模型對優化沃柑果皮果膠的提取工藝可行。

2.3 果膠理化性質結果分析

將優化的沃柑果皮理化指標進行測定，結果發現，沃柑果膠水分含量為10.5%、酸不溶灰分含量0.48%、總半乳糖醛酸含量為72.6%，均符合GB 25533—2010《食品安全國家標準食品添加劑果膠》對果膠的要求。酯化度為89.9%，所提取的果膠純度相對較高，屬于高酯果膠（DE＞50%）。酯化度越高的果膠其凝膠速度越快，高酯果膠可以用于奶制品，在加熱的時候，pH為3.5～4.2之間的條件下可以防止酪蛋白的聚集，適合用于已經被巴氏殺菌或超高溫殺菌過的酸乳、酸豆乳和牛乳跟果汁混合物里面。根據測定的沃柑皮果膠的理化數據來看，通過酸法提取得到的沃柑皮果膠是一種純度相對較高的優質高酯果膠。

3 結論

本研究通過優化酸法提取沃柑皮果膠的提取工藝，并測定其理化性質，探索了沃柑果皮中果膠的提取可能性和應用價值。研究結果表明，最佳提取工藝條件為液料比50∶1（mL∶g）、提取pH值為1.3、提取溫度為89 ℃、提取時間為97 min。在此條件下，沃柑果膠得率為21.36%，其水分含量為10.5%、酸不溶灰分含量為0.48%、半乳糖醛酸含量為72.6%、酯化度為89.9%。這些理化指標均滿足果膠的國家標準要求。酸法能夠有效地提取沃柑皮果膠，并且所得果膠質量優良、適用性好，具有廣闊的應用前景。