長時間血清饑餓脅迫對豬骨骼肌衛星細胞代謝和自噬的影響

高 娟,范博鈞,吳雅婕,王 怡,楊躍飛,鞠輝明

(1. 揚州大學廣陵學院,江蘇 揚州 225000;2.揚州大學獸醫學院 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇 揚州 225009)

骨骼肌衛星細胞(Skeletal muscle satellite cells,SMSCs)最早由Mauro于1961年發現,是分布于成年個體肌肉組織內,肌細胞基底膜與肌膜之間,未分化的、處于靜止狀態的肌前體細胞[1]。當肌肉受到損傷或者發生肌肉退化疾病而引起應激時,SMSCs可以通過肌源性分化而形成肌纖維[2]。細胞自噬通過形成自噬體,將蛋白質和糖原顆粒等生物大分子或線粒體等細胞器回收至溶酶體,最終將其降解為氨基酸和單糖等小分子[3]。細胞自噬實現了能量物質的循環再利用,是高度保守的過程[4]。研究表明,骨骼肌在饑餓狀態、廢用性萎縮、缺氧和鍛煉時,其自噬通量會增加[5-7]。多個因子和信號通路已被證明有助于自噬通量的調節。其中,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)參與自噬通量的控制,且直接與骨骼肌的再生和修復密切相關[8]。一定量的ROS對于調節細胞生長和維持細胞的各種生物學功能是必不可少的,但一些退行性疾病、骨骼肌疾病、糖尿病和衰老等會導致ROS平衡被破壞,進而影響骨骼肌代謝[9]。目前,雖然有證據表明肌肉纖維恢復過程與SMSCs自噬密切相關[5,10],但自噬影響肌肉再生和修復的具體途徑和精確機制仍有待系統研究。本試驗通過長時間控制SMSCs培養體系中的血清濃度,檢測不同程度血清饑餓脅迫對細胞代謝和自噬的影響,以期為后續探索營養脅迫影響豬骨骼肌發育和肌肉生成的差異機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養基,購自Hyclone公司;PBS和青霉素鏈霉素雙抗,購自美國Gibco公司;anti-LC3b和anti-p62抗體,均購自美國Abcam公司;anti-AMPK、anti-mTOR、anti-p-mTOR和anti-Tubulin抗體,均購自美國Proteintech公司;anti-p-AMPK抗體,購自美國GeneTex公司;細胞凋亡試劑盒、線粒體膜電位試劑盒、活性氧檢測試劑盒和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)檢測試劑盒,均購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 CO2恒溫細胞培養箱(Heracell 150i),購自美國Thermo公司;蛋白電泳儀(PowerPacTM Basic),購自美國Bio-Rad公司;流式細胞儀(CytoFLEX),購自美國Beckman Coulter有限公司;全自動化學發光圖像分析系統(Tanon-5200),購自中國天能公司;多功能酶標儀(BioTek Synergy),購自美國Biotek Synergy公司。

1.3 細胞來源 原代姜曲海豬SMSCs 由本實驗室分離鑒定并保存。

1.4 細胞分組和處理 SMSCs培養于含20%胎牛血清的DMEM培養基中,隨機分為5個組:培養基中含20%血清的細胞為正常對照組(20%S組),培養基中分別含15%、10%、5%和不含血清的細胞分別為15%S、10%S、5%S和0%S組。各組細胞在不同血清濃度條件下培養96 h,進行細胞代謝相關指標和自噬相關蛋白檢測。每組3個樣本重復,進行3次試驗重復。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率、線粒體膜電位和ROS水平 收集各組細胞,制備細胞懸液,800 r/min離心5 min,棄上清。按照試劑盒說明書操作,使用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率、線粒體膜電位和ROS水平。

1.6 細胞內ATP水平測定 收集各組細胞,制備細胞懸液,800 r/min離心5 min,棄上清。按照ATP檢測試劑盒操作說明書操作,測定各組細胞中ATP水平。

1.7 Western blot檢測細胞自噬相關蛋白的表達 收集各組細胞,提取細胞總蛋白。測定各組細胞總蛋白濃度,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉印、封閉后加入一抗,包括LC3b、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和Tubulin,4 ℃過夜振蕩孵育。洗膜后根據一抗選擇相應的二抗,使用全自動化學發光圖像分析系統進行顯影。用Image J和Analysis軟件測定雜交條帶的灰度值。目標蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值為各目標蛋白的相對表達量[11]。

1.8 統計學分析 試驗數據均用“平均值±標準差(Mean±SD)”表示,應用GraphPad Prism 7軟件對數據進行單因素方差分析,組間差異采用t檢驗,以P>0.05為差異不顯著,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測細胞凋亡率 結果如圖1所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S組SMSCs細胞凋亡率分別為(6.33±0.19)%、(7.58±0.7)%、(8.14±0.53)%、(8.51±0.3)%和(11.46±0.32)%;與20%S組相比,0%S和5%S組細胞凋亡率極顯著上調(P<0.01),10%S組細胞凋亡率顯著上調(P<0.05),15%S組細胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)。

2.2 流式細胞術檢測細胞中線粒體膜電位 JC-1探針紅、綠熒光比率代表線粒體膜電位值,結果如圖2所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S組細胞線粒體膜電位值分別為(12.72±0.55)%、(8.01±0.38)%、(6.77±0.16)%、(3.57±0.22)%和(2.81±0.04)%;與20%S組相比,0%S、5%S、10%S和15%S組細胞線粒體膜電位均極顯著下降(P<0.01)。

圖2 各組細胞線粒體膜電位檢測和分析

2.3 流式細胞術檢測細胞ROS水平 結果如圖3所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S組細胞ROS水平分別為(15.87±0.42)%、(29.96±0.46)%、(31.95±0.54)%、(39.46±1.42)%和(60.68±0.42)%;與20%S組相比,0%S、5%S、10%S和15%S組細胞ROS水平均極顯著提升(P<0.01)。

圖3 各組細胞ROS水平檢測和分析

2.4 細胞內ATP水平測定 結果如圖4所示,20%S、15%S、10%S、5%S和0%S組細胞中ATP水平分別為(4.12±0.23)、(8.01±0.3)、(9.86±0.36)、(12.64±0.55)和(23.59±2.03) nmol/L;

圖4 各組細胞ATP水平檢測

與20%S組相比,0%S、5%S、10%S和15%S組細胞中ATP水平均極顯著提升(P<0.01)。

2.5 Western blot檢測細胞自噬相關蛋白的表達 以Tubulin為內參,Western blot檢測自噬標志蛋白LC3b、p62和AMPK/mTOR信號通路相關蛋白的表達。其中,LC3b-Ⅱ與LC3b-Ⅰ蛋白條帶灰度值的比值代表LC3b蛋白的水平,通過p-mTOR/mTOR和p-AMPK/AMPK的比值變化分析AMPK/mTOR信號通路是否參與自噬的發生。結果如圖5所示,細胞中LC3b蛋白的相對表達量隨血清濃度降低而升高,p62蛋白的相對表達量隨血清濃度降低而降低。與20%S組相比,15%S、10%S、5%S和0%S組LC3b蛋白的相對表達量均極顯著上調(P<0.01);10%S、5%S和0%S組p62蛋白的相對表達量均極顯著降低(P<0.01),15%S組p62蛋白的相對表達量顯著降低(P<0.05)。p-mTOR/mTOR比值隨血清濃度降低而降低,p-AMPK/AMPK比值隨血清濃度降低而升高。與20%S組相比,10%S、5%S和0%S組p-mTOR/mTOR和p-AMPK/AMPK比值均差異極顯著(P<0.01),15%S組差異顯著(P<0.05)。

圖5 Western blot檢測細胞自噬及其信號通路相關蛋白的表達

3 討論

SMSCs對動物個體出生后的肌肉發育、維持和再生具有重要作用,其受到損傷或者某些因素刺激后具有增殖和分化的能力,這直接決定了骨骼肌的生長發育和產肉性狀。SMSCs在體內外的生長代謝需要一定營養能量的支撐,在體外細胞培養體系中添加一定濃度的血清可滿足細胞的能量需求,血清中含有細胞生長所需的生長因子、維生素、核酸衍生物、激素和其他多種未知營養物質[12]。為了全面研究不同營養條件下動物個體肌肉發育的差異,在細胞水平檢測SMSCs在不同營養條件下代謝水平的變化非常重要。細胞代謝是細胞內用于維持生命的各種各樣的化學反應的總稱,通過測定細胞中線粒體膜電位、細胞凋亡率、ROS和ATP水平可以較好地評估環境對細胞代謝的影響[13-16]。本試驗結果顯示,隨著SMSCs培養體系中血清濃度的降低,細胞凋亡率升高、線粒體膜電位降低、ROS和ATP水平升高,這種變化趨勢與血清濃度降低的程度呈正相關,說明長時間(96 h)血清饑餓脅迫能加速細胞代謝、促進細胞凋亡,對細胞有毒害作用。本團隊前期研究了短時間(24 h)血清饑餓脅迫對SMSCs代謝的影響,發現低程度的血清饑餓(15%S)在加速細胞代謝的同時,對細胞凋亡影響不大,而更嚴重的血清饑餓脅迫(10%S、5%S和0%S)則會導致細胞代謝加快的同時,加速細胞凋亡[17]。

自噬是細胞通過分解亞細胞內容物以維持營養和能量動態平衡的一種保護機制。一定程度的自噬有助于細胞的修復和再生,而過度的自噬則會對細胞功能產生負面影響,進而導致細胞凋亡[18]。目前已有證據表明,自噬可以調節SMSCs的分化[19-20],然而不同程度的自噬可能對細胞的代謝及分化功能產生不同影響,最終可能成為影響動物個體肌肉發育的重要因素,但相關工作尚未見報道。營養饑餓是誘導自噬的最典型的應激源,本試驗通過控制SMSCs培養基中的血清濃度來模擬營養物質缺乏,檢測SMSCs發生自噬的程度。作為細胞自噬標志蛋白,p62和LC3b常被用于檢測自噬發生。LC3b是自噬標志物,自噬形成時胞漿型LC3b(即LC3b-I)會酶解掉一小段多肽,轉變為(自噬體)膜型(即LC3b-II)。p62水平升高通常標志著自噬活性受到抑制[21-23]。本試驗結果顯示,長時間血清饑餓脅迫后,細胞中p62蛋白相對表達量降低,而LC3b蛋白表達趨勢正好與p62相反,說明血清濃度降低能夠誘導細胞發生自噬,而且自噬程度與血清饑餓程度呈正比。AMPK/mTOR信號通路是細胞自噬發生的經典信號通路之一,AMPK激活后磷酸化mTOR調節相關蛋白,進而降低mTOR的磷酸化,mTOR的生物學功能被抑制,AMPK的活化和mTOR的抑制兩者互相協作,共同啟動自噬[24-25]。本試驗結果顯示,SMSCs培養體系中血清濃度降低后,p-AMPK/AMPK比值顯著上升的同時,p-mTOR/mTOR比值顯著降低,而且變化趨勢和血清饑餓程度呈正比,表明SMSCs在血清饑餓脅迫后可通過AMPK/mTOR 通路激活細胞自噬,而且自噬的程度和血清降低的程度呈正相關。

本試驗發現了長期降低SMSCs培養體系中血清濃度可以加速細胞代謝和凋亡,并且通過AMPK /mTOR信號通路激發細胞自噬,上述變化的程度和血清減少的程度呈正相關。本試驗結果有助于后續研究不同程度饑餓脅迫對動物肌肉發育的影響,探究新的動物飼養模式。