桿菌肽在獸醫臨床的研究進展

王育丹,霍美霞,劉海燕,黃玲利,3

(1. 華中農業大學動物醫學院 國家獸藥殘留基準實驗室,湖北 武漢 430070;2. 國家獸藥安全評價實驗室,湖北 武漢 430070;3. 農業農村部獸藥殘留檢測重點實驗室,湖北 武漢 430070)

桿菌肽(Bacitracin,BAC)是一種多肽類抗生素,由地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的某些菌株所產生[1],作用于革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌(螺旋體、放線菌等),在動物體內代謝快,殘留少,主要產品為桿菌肽鋅(Bacitracin zinc,BZ)和亞甲基水楊酸桿菌肽(Bacitracin methylene disalicylate,BMD)。近年來,由于抗菌藥物使用不科學和不合理,動物源性細菌耐藥性不斷增加,對動物源性食品安全和公共衛生安全造成了威脅。我國在2019年發布第194號公告,禁止了除中藥外的促生長類藥物的使用。本文著重對桿菌肽的殘留檢測和獸醫臨床應用的研究進展進行綜述,為桿菌肽的臨床應用提供理論支撐。

1 桿菌肽理化性質

桿菌肽,又叫枯草菌肽、枯草菌素,分子式為C66H103N17O16S,分子量為1 421.68。該藥物呈淡黃或白色粉末狀,有引濕性,味苦,無臭味,易溶于水,可溶解于乙醇、乙醚和丙酮溶液,與多種重金屬鹽類發生沉淀,耐酸性、煮沸、胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。干式桿菌肽粉劑和非水性軟膏在室溫下非常穩定,若不冷藏,桿菌肽在水溶液和水溶性堿中很快就會變質。

桿菌肽存在多種異構體,是1個十二肽混合物,由1個噻唑啉環和1個七肽環構成,環狀結構和鏈狀結構分別由7個氨基酸和5個氨基酸組成[2],桿菌肽結構如圖1所示。

圖1 桿菌肽的結構式

桿菌肽主要產品有BZ和BMD,主要成分為桿菌肽A和桿菌肽B,含量占桿菌肽的95%以上[3]。其中,桿菌肽A的活性成分含量最高,由7個多肽組成,呈環狀結構,含有1個位于?；腘末端的噻唑啉環[4]。

2 桿菌肽作用機制和特點

桿菌肽作用于大部分革蘭陽性菌和螺旋體等部分革蘭陰性菌。研究發現,桿菌肽對各種細菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)分別為產氣莢膜梭菌256 μg/mL[5]、金黃色葡萄球菌16 μg/mL、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌32 μg/mL、耐甲氧西林表皮葡萄球菌32 μg/mL[6]、糞球腸菌32～48 μg/mL、變形鏈桿菌78.12 μg/mL[7]。

將大麻素大麻二酚(Cannabinoid cannabinol,CBD)與桿菌肽合用,CBD可增強桿菌肽對革蘭陽性菌(葡萄球菌屬、單核細胞增生李斯特菌和糞腸球菌)的作用,且MIC降低了至少64倍[8]。將粘菌素與桿菌肽聯合使用,可以使金黃色葡萄球菌的MIC降到1/2 MIC[9]。研究表明,豬鏈球菌和產氣莢膜梭菌等對桿菌肽具有耐藥性,許多革蘭陽性菌生物體中存在“Bce型”三磷酸腺苷結合盒(ATP binding cassette,ABC)轉運蛋白,該蛋白能形成具有雙組分系統的蛋白質復合物,這些組分共同感知并對細胞表面的桿菌肽產生抗性[10]。Ma等[11]通過比較基因組學和蛋白質同源性分析發現,有毒的豬鏈球菌菌株都含有SstFEG編碼的1種潛在的外排泵,SstFEG參與豬鏈球菌在動物感染模型中的定植,通過其潛在的競爭性生存優勢對抗宿主的殺菌作用。

桿菌肽的抑菌機制主要有3種:(1)阻礙細菌細胞壁的合成,Siewert等[12]研究表明,桿菌肽通過脂質載體的去磷酸化而阻礙脂質載體進入細胞,從而抑制肽聚糖的合成,最終抑制細菌細胞壁的合成;(2)損害細菌細胞膜的通透性,導致細胞無法維持滲透壓平衡,從而引起細菌破裂死亡[13];(3)誘導細菌核酸降解,尤其是RNA,Ciesioka等[14]采用幾種模型RNA和DNA寡聚物檢測桿菌肽的核酸降解活性,結果表明,桿菌肽通過誘導鳥苷殘基中RNA的降解而干擾了細菌蛋白的合成。近年來也有研究表明,桿菌肽還可以影響細菌生物膜的形成,Zaidi等[7]使用1/2 MIC,即39.06 μg/mL的桿菌肽處理變形鏈球菌后,其生物膜的形成顯著降低。

桿菌肽經口服后幾乎不被胃腸道吸收,在器官和組織中的分布可忽略不計。在大鼠、雞和豬中,約95%的口服劑量通過糞便排泄,僅3%或更少通過尿液排泄。桿菌肽通過主要代謝產物脫酰胺桿菌肽代謝為氨基酸和較小的肽,在微生物學上不起作用。糞便中的主要代謝物為桿菌肽A、B1、B2、F、脫酰胺桿菌肽和分解代謝肽,尿液和膽汁中僅存在水解裂解產物(二肽和三肽)[15]。

3 桿菌肽安全性

3.1 桿菌肽的毒理學特征 根據給藥途徑的不同,桿菌肽表現出不同程度的毒性反應。注射時毒性最強,口服時毒性最弱。桿菌肽經不同途徑給藥對小鼠、大鼠和鵪鶉的急性毒性半數致死量(Median lethal dose,LD50)如表1所示[16]。

表1 桿菌肽經不同途徑給藥對不同動物的LD50[16]

全身應用桿菌肽時會損傷腎臟,主要表現在腎小管,同時抑制腎小球的濾過功能,引起嚴重的腎毒性反應,有時甚至會出現蛋白尿和管型尿等現象,腎功能逐漸退化,嚴重者可導致急性腎小管壞死和動物死亡。當桿菌肽使用劑量接近LD50時,會對小鼠的腎小管造成損害,偶爾對猴子造成損害,但對大鼠和犬的損害較小;局部應用時,可能會導致過敏,主要表現為皮膚紅腫、皮疹和局部瘙癢,偶爾出現嚴重的全身過敏[16]。

3.2 桿菌肽在靶動物的安全性 桿菌肽具有優良的安全性。BZ按250 mg/(kg·bw)劑量給藥,對4周齡仔豬無明顯的臨床和病理損傷,表明BZ對仔豬無毒副作用。桿菌肽的污染物致突變性檢測(Ames)試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和睪丸染色體畸變試驗的結果也均為陰性[17]。

孫晨明等[18]研究了BMD預混劑對雞的安全性,按臨床推薦劑量55 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍劑量混飼連續給藥42 d,結果顯示,所有受試動物均存活,臨床表現、病理剖檢和血液生理生化指標均無異常。賀文慶[19]研究了BMD預混劑對鴨的安全性,按臨床推薦劑量50 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍劑量混飼連續給藥42 d,結果顯示,所有試驗組動物均未死亡,且臨床表現、病理剖檢和血液生理生化指標均正常。胡雪[20]研究了BMD可溶性粉對兔的安全性,受試藥以桿菌肽計,按臨床推薦劑量6 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍劑量混飲連續給藥21 d,結果顯示,兔發育正常,病理剖檢也未見異常。上述研究表明,BMD按推薦劑量給藥,對靶動物雞、鴨和兔具有較大的安全性。

4 桿菌肽在動物體內的殘留消除研究

歐盟規定:牛奶中桿菌肽的殘留不超過100 μg/kg,兔可食性組織中桿菌肽的殘留量不超過150 μg/kg[15]。美國規定:在牛、豬、雞、火雞、稚雞、鵪鶉以及奶和蛋中,桿菌肽的殘留量不超過500 μg/kg[21]。我國《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》標準規定:桿菌肽在豬、牛和家禽的可食性組織及禽蛋和奶中的最大殘留量不超過500 μg/kg[22]。

4.1 桿菌肽殘留檢測方法 目前,桿菌肽殘留檢測方法主要有微生物檢測法、免疫分析法、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、毛細管電泳色譜法和液相色譜-串聯質譜法(Liquid chromatography mass spectrometer,LC-MS/MS),具體原理和優缺點見表2。

表2 桿菌肽殘留檢測方法

4.1.1 微生物檢測法 王正彬等[23]建立了桿菌肽在草魚、鰻鱺和對蝦肌肉中的測定方法,該方法選擇藤黃微球菌(Micrococcusluteus)為檢測菌種,以0.1%甲酸水-甲醇(7∶3)提取藥物,正己烷除脂,當不同水產品肌肉組織中桿菌肽添加濃度在0.5～2.5 μg/g時,各組織回收率均在70%以上,變異系數均在15%以下。郭桂芳等[24]建立了豬可食性組織中桿菌肽的殘留檢測方法,當豬組織樣品中桿菌肽添加濃度在 0.025～0.1 IU/g時,回收率均在80%以上,檢測限(Limit of detection,LOD)為0.025 IU/g(相當于410 μg/kg)。

4.1.2 免疫分析法 那冠瓊[25]通過人工合成免疫原免疫小鼠后成功制備單抗,建立了檢測牛奶中BZ殘留的膠體金試紙條;牛奶樣品中桿菌肽添加濃度在0.97～10.29 ng/mL范圍內,裸眼LOD為25 ng/mL,儀器掃描灰度值LOD為0.82 ng/mL,平均回收率在80%以上,變異系數小于15%。劉宏軍等[26]制備了ELISA檢測試劑盒,可用于檢測豬肉、豬肝和牛奶中桿菌肽的殘留,檢測范圍在1.0～81.0 μg/L,豬肉、豬肝和牛奶的 LOD分別為20、20和26 μg/kg,線性關系良好(r>0. 99),平均回收率在70%以上,變異系數在15%以下,表明該ELISA檢測試劑盒具有靈敏度高、檢測快速和穩定等特點。

4.1.3 高效液相色譜法 焦洋[27]建立了檢測脂質體中桿菌肽含量的高效液相色譜法,以磷酸鹽緩沖液-甲醇(60∶40,pH 6)為流動相等度洗脫,檢測波長為254 nm,藥物濃度在0.061～1.830 μg/mL范圍內,檢測濃度與目標峰面積線性關系良好,平均回收率達100.53%。常用的液相檢測器主要有紫外檢測器(Ultraviolet detector,UVD)、熒光檢測器(Fluorescence detector,FLD)、蒸發光散射檢測器(Evaporative light-scattering detector,ELSD)和化學發光檢測器(Chemiluminescent detector,CD)。其中,FLD靈敏度高,選擇性強,應用廣泛,可用于能激發熒光的化合物的檢測,而多肽類藥物多數無熒光反應,經衍生后方可使用該方法,常用的衍生化制劑有異氰硫基苯和鄰苯二甲醛。Capitan-Vallvey等[28]建立了檢測動物飼料中桿菌肽含量的高效液相色譜-熒光檢測法(High performance liquid chromatography-fluorescence detection,HPLC-FLD),以鄰苯二甲醛為衍生制劑,該方法的LOD為2.5 mg/L,定量限(Limit of quantification,LOQ)為7.5 mg/L。

4.1.4 毛細管電泳色譜法 Injac等[29]建立了測定飼料中BZ含量的膠束電動毛細管電泳色譜法,在毛細管中因電場力的驅動,目標物和其他物質在膠束相和水相間發生分配行為,從而遷移分離,該方法的LOD為4.72 mg/L。因毛細管管徑的限制,雷霄云等[30]通過對毛細管加壓,與靈敏度更高的激光誘導熒光檢測器聯用,用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱[4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole,NBD-F]衍生后,建立了用于多肽類抗生素殘留檢測的毛細管電色譜-激光誘導熒光聯用技術(Capillary electrochromatography-laser induced fluorescence,CEC-LIF),該技術適用于檢測牛奶和飼料中包括桿菌肽在內的3種環狀多肽,該方法的LOD為10 ng/mL,回收率介于72.9%～112.4%,可滿足相關殘留檢測要求。

4.1.5 液相色譜-串聯質譜法 LC-MS/MS是檢測飼料中獸藥含量和分析獸藥殘留的重要手段。高嫣珺等[31]建立了動物可食性組織和禽蛋中桿菌肽殘留的高效液相色譜-串聯質譜法(High performance liquid chromatography mass spectrometry,HPLC-MS/MS)檢測方法,藥物濃度在50～1 000 ng/g,組織中桿菌肽添加濃度與目標峰面積有較好的線性關系,平均回收率大于70%,批內和批間變異系數均小于15%。除上述方法外,超高效液相色譜-串聯質譜法(Ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry,UPLC-MS/MS)可提高分析效率和檢測靈敏度,使樣品在短時間內完成分離。杜業剛等[32]建立了一種可同時測定動物源性食品中8種多肽類抗生素的檢測方法,結果顯示,在10～1 000 μg/L范圍內,線性關系良好,回收率和變異系數均滿足檢測要求。Bladek等[33]開發并驗證了可用于測定動物肌肉、牛奶和雞蛋中多肽抗生素殘留的新型UPLC-MS/MS方法,該方法首次基于堿性提取劑來檢測動物源性食品中多肽類抗生素,與采用酸性萃取相比,該方法具有新穎性,可對10～1 000 μg/kg線性范圍內的多肽進行定量,回收率在70%～99%,變異系數小于15%,具有較好的實用性。

4.2 桿菌肽在動物體內的殘留消除特征 全家興[3]將BMD可溶性粉按6 mg/(kg·bw),2 次/d,連續10 d混飼給藥,研究桿菌肽在兔子可食性組織中的殘留消除規律,結果表明,桿菌肽在兔子可食性組織中無殘留。賀文慶[19]將BMD按250 mg/kg濃度添加在飼料中,連續飼喂20 d后,對雞的可食性組織中的藥物殘留進行檢測,結果表明,BMD在雞體內無殘留。

5 桿菌肽臨床應用

在畜禽上,桿菌肽主要用作飼料添加劑,用于提高飼料的轉化率和畜禽的體重,也可用于治療畜禽腸道感染性疾病。2019年,我國農業農村部發布第194號公告,規定自2020年1月1日起,桿菌肽不可再作為促生長劑進行使用。

研究發現,桿菌肽可用于治療畜禽胃腸道疾病,臨床上主要用于防治畜禽的壞死性腸炎,產品主要是BZ和BMD。胡雪[20]開展的藥效學試驗證明,在推薦劑量6 mg/(kg·bw·d),連續混飲給藥10 d,BMD能有效治療兔壞死性腸炎,且無不良反應。沈建忠等[34]研究也表明,BMD對C型魏氏梭菌有明顯的抑菌作用,MIC為1.5 μg/mL,在推薦劑量每公斤飲水中分別加入50、100和200 mg BMD,連續混飲給藥7 d,對雞壞死性腸炎具有良好的療效。Kyriakis等[35]將仔豬斷奶后到156 d分為3個階段,以3種劑量將BZ混飼給藥,發現36個治療組的表現均優于對照組,且高劑量組(300或200 ppm)優于低劑量組(200或100 ppm、100或50 ppm)。將BMD按275 mg/kg添加在母豬圍產期(產前2周～產后3周)飼料中,可用來控制仔豬的梭菌腸炎[36]。同時,美國也已經批準BMD用于控制豬痢疾。

桿菌肽對動物腸道健康也有一定的影響。Chen等[37]用不同濃度的BMD進行日糧補充,飼喂斷奶兔35 d,結果顯示,在補充劑量為50～100 mg/kg的情況下,BMD能夠提高腸道吸收能力,改善腸道酸堿度,利于有益細菌的存活,維持腸道的健康。Proctor等[38]按100 mg/kg劑量將BMD加入30日齡仔雞的日糧中連續18 d后,仔雞腸道微生物多樣性提高,腸道穩定性增強,同時壞死性腸炎等胃腸道疾病暴發期間的潛在病原體減少。

6 展望

近年來,各國對獸藥濫用和細菌耐藥性問題越來越重視,我國已禁止桿菌肽在獸醫臨床中作為促生長制劑使用。美國、韓國等多個國家已經批準其產品BMD用于豬梭菌性腸炎的治療,大量研究也已經表明,BMD可以用于治療雞和兔的壞死性腸炎?；跅U菌肽無殘留和安全性好等特點,未來可促進該藥物轉治療注冊的申請,在畜禽的胃腸道疾病方面發揮治療作用。同時,由于桿菌肽廣泛的應用和耐藥性的產生,建立方便、快捷和靈敏的殘留檢測方法,對于其在臨床的合理使用尤為重要。