綜合洗消體系對阻斷非洲豬瘟病毒傳入豬場的作用

張 韻,金睿妍,何佳蔚,程光勝,丁紅雷

(1. 西南大學動物醫學院 動物支原體學實驗室,重慶 北碚 400715;2. 重慶正大農牧食品有限公司,重慶 江北 400021)

自2018年8月3日我國首例非洲豬瘟(African swine fever,ASF)病例確診以來,短短數月時間,該病就席卷我國大江南北,給養豬業造成巨大經濟損失[1-2]。由于低毒力菌株在田間的流行[3],有些非洲豬瘟陽性豬不表現出典型臨床癥狀,給非洲豬瘟陽性豬的清除帶來了很大挑戰,甚至造成非洲豬瘟在豬場內流行,最后不得不全群淘汰。在沒有良好疫苗的情況下,加強生物安全管理仍然是防控非洲豬瘟最為經濟有效的手段。

動物傳染病的流行過程就是從個體發病發展到群體發病的過程[4]。傳染病在動物群體中蔓延流行,必需具備3個相互連接的條件,即傳染源、傳播途徑和易感動物。在當前條件下,徹底消滅非洲豬瘟的傳染源極其困難,并且沒有有效的非洲豬瘟疫苗也無法保護易感動物[5-6]。建立嚴格的洗消體系,加強進入豬場前車輛、人員和物資的洗消,切斷傳播途徑,阻斷非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)傳入豬場是養殖企業防控非洲豬瘟切實可行的辦法[7]。

2019—2022年,本試驗通過在某種豬場建立綜合洗消體系,加強對進入豬場前車輛、人員和物資的洗消,并結合洗消后車輛、人員和物資的ASFV核酸實時熒光定量PCR檢測,將種豬場傳入ASFV的概率降至最低水平,最大限度地切斷了傳播途徑,為種豬場安全生產提供了有力保障。

1 材料與方法

1.1 試驗豬場 重慶市某農牧企業下屬某種豬場,存欄母豬1 200頭。該種豬場10 km半徑內無其他豬場、活畜交易市場、畜禽無害化處理場、畜禽屠宰場和垃圾處理廠,豬場距離公共交通道路超過1 km。除了進出豬場的內部道路,場區周圍以樹木作為天然隔離帶。飲水由自來水廠供應。

1.2 主要試劑和儀器 DNA病毒基因組提取試劑盒,購自青島立見生物科技有限公司;ASFV實時熒光定量PCR檢測試劑盒,購自濟凡生物科技(常州)有限公司;ASFV ELISA抗體檢測試劑盒,購自北京金諾百泰生物技術有限公司;正立凈(濃戊二醛溶液),購自正大預混料(廣漢)有限公司;衛清寧(過硫酸氫鉀復合粉),購自天津瑞普生物技術有限公司。高速冷凍離心機,購自安徽中科中佳科學儀器有限公司;酶標儀和實時熒光定量PCR儀,均購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.3 進入豬場車輛的洗消 對進入種豬場的飼料配送車、物資配送車、仔豬轉運車和淘汰豬運輸車進行三級洗消。所有洗消按照從外到里、從表面到內部、從大體到細節的順序進行。一級洗消:飼料配送車在飼料廠附近的洗車場、物資配送車在該農牧企業存儲物資的中心庫房附近的洗車場、仔豬轉運車在肥豬場附近的洗車場、淘汰豬運輸車在屠宰場附近的洗車場進行清洗和消毒。清洗和消毒的部位包括整車車身外壁、內壁、底盤和駕駛室。二級洗消:所有車輛在接近種豬場附近1 km設立的洗消中心進行整車車身外壁和內壁、底盤和駕駛室的二級洗消(圖1)。洗消完畢后烘干車輛,70 ℃烘干至少10 min,時間達到后,關閉熱風機,20～30 min后采樣(圖2)。三級洗消:在種豬場門口對整車車身和底盤進行噴霧消毒。用于一級和二級洗消的消毒劑為0.1%戊二醛,用于三級洗消的消毒劑為衛清寧(1∶200稀釋),消毒劑至少作用1 h。

圖1 二級洗消

圖2 車輛烘干過程的溫度控制

1.4 進入豬場車輛的樣品采集 采樣人員穿好一次性防護服,戴一次性手套。用生理鹽水將紗布塊浸濕,依次對車輛的各個部位進行擦拭,包括駕駛室的車門把手、扶手欄桿、方向盤、操作檔桿和按鈕、雨刷、儀表盤、掛擋、座椅、踏板、駕駛室地面、駕駛員鞋底和副駕駛位等;車體表面的車頭、車身兩側、車尾、車底輪胎、擋泥板、水箱和底盤等;仔豬轉運車車廂各層的地板、側壁、欄桿、車頂、尾板和窗戶等。用浸濕的植絨拭子涂抹紗布無法采集的地方,包括縫隙(如駕駛室踏板的縫隙和輪胎縫隙等)、直角邊、欄桿內部、孔隙和風扇葉等邊角地方。每次二級洗消完畢均在上述位置進行采樣。每5個采樣部位合用1個植絨拭子或1塊紗布。將采樣后的紗布和拭子放入采樣袋,標記車牌號、采樣日期、洗消中心名稱和豬場名稱等信息。每份樣品密封完好,防止滲漏和互相污染,以豬場和洗消中心為單位保存和送檢。

1.5 進入豬場人員的洗消和樣品采集 豬場人員進入洗消通道后,換鞋、換衣,進入洗澡間洗澡,換干凈的豬場內工作服。之后進入生活區隔離24 h。進入生活區后進行棉拭子采樣,采樣部位包括頭發、鼻孔、耳朵和手指甲縫。換下的衣物經紫外線照射和噴霧消毒2 h,對衣物表面和鞋底進行植絨拭子采樣。每5個采樣部位合用1個植絨拭子或1塊紗布。

1.6 進入豬場物資的消毒和樣品采集 根據物資的不同采用不同的消毒方法。例如,對獸藥進行噴霧和紫外線消毒,對米、面和油等進行紫外線消毒。物資采樣的部位根據物資的不同采用表面、內部或表面+內部的采樣方式。每5個采樣部位合用1個植絨拭子或1塊紗布。

1.7 豬只血液采集和處理 于豬只前腔靜脈采血,每頭豬采集血液2～5 mL,4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取血清。若有溶血,則再次于4 ℃、5 000 r/min離心10 min,取上清,盡量去掉細胞成分。按體積比1∶1加入甘油,充分振蕩混勻后,-20 ℃保存。

1.8 ASFV實時熒光定量PCR檢測 在放置植絨拭子樣品或紗布樣品的滅菌離心管中加入0.5 mL生理鹽水,渦旋儀震蕩30～60 s,室溫靜置1～2 h,使病毒從樣品中充分釋放。12 000 r/min室溫離心3 min,取0.2 mL上清提取基因組。血清樣品則直接提取基因組。實時熒光定量PCR反應條件:37 ℃孵育2 min;95 ℃預變性20 s;95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,共40個循環。根據試劑盒說明書對檢測結果進行判定。

1.9 ASFV抗體ELISA檢測 用樣品稀釋液將待檢血清按1∶100(V/V)進行稀釋。每孔加入稀釋好的待檢血清100 μL,同時設陽性和陰性對照。置37 ℃恒溫培養箱孵育30 min。棄去孔中液體,洗滌液洗滌4次,拍干。每孔加入工作濃度酶標抗體100 μL,37 ℃孵育30 min。棄去孔中液體,洗滌液洗滌4次,拍干。每孔加入底物液100 μL,37 ℃避光孵育10 min。每孔加入終止液50 μL,振蕩混合均勻后,在450 nm波長下讀取光密度(Optical density,OD)值。根據試劑盒說明書計算結果并對結果進行判定。

2 結果

2.1 進入種豬場車輛ASFV核酸的檢出情況 2019—2022年,對洗消后進入豬場的608臺車輛進行2次洗消后檢測ASFV核酸,共有6輛車為ASFV核酸陽性,整體ASFV檢出率為1.0%;2019、2020、2021和2022年的ASFV檢出率分別為2.6%(4/156)、1.3%(2/150)、0(0/162)和0(0/140)(表1)。4年間,飼料配送車、物資配送車和仔豬轉運車均未檢測到ASFV核酸,但2019和2020年淘汰豬運輸車的ASFV檢出率分別為33.3%(4/12)和16.7%(2/12)。

表1 進入豬場車輛ASFV核酸的檢出情況

2.2 進入豬場人員ASFV核酸的檢出情況 豬場人員進入洗消通道洗消后,在隔離房間采樣檢測ASFV核酸,整體ASFV檢出率為1.3%(5/394)。2019、2020、2021和2022年的ASFV檢出率依次為3.0%(3/100)、1.1%(1/92)、0(0/88)和0.9%(1/114)(表2)。

表2 進入豬場人員ASFV核酸的檢出情況

2.3 進入豬場物資ASFV核酸的檢出情況 2019—2022年,入場物資消毒后整體ASFV檢出率為3.8%(3/79);2019、2020、2021和2022年的ASFV檢出率分別為12.5%(2/16)、0(0/18)、5.9%(1/17)和0(0/28)(表3)。從入場物資類型來看,藥品和疫苗未檢測到ASFV核酸;生活物資(如米、面、油、調味品、干貨及其包裝)的整體ASFV檢出率為5.9%(3/51),每年的ASFV檢出率依次為20.0%(2/10)、0(0/12)、9.1%(1/11)和0(0/28)。

表3 進入豬場物資ASFV核酸的檢出情況

2.4 豬只ASFV核酸的檢出情況 2019—2022年對該種豬場的斷奶仔豬、后備母豬和生產母豬進行ASFV核酸檢測,所有樣品均未檢測到ASFV(表4)。

表4 豬只ASFV核酸的檢出情況

2.5 豬只ASFV抗體的檢出情況 2019—2022年對該種豬場的斷奶仔豬、后備母豬和生產母豬進行ASFV抗體檢測,檢測結果均為陰性(表5)。

表5 豬只ASFV抗體的檢出情況

3 討論

鑒于非洲豬瘟的高致死率以及沒有有效的疫苗可以防控該病,嚴格的生物安全措施成為防控該病最為經濟有效的手段,防止ASFV傳入豬場則是該病防控的關鍵環節[8]?；诖?可通過對進入豬場前的車輛、人員和物資進行洗消,最大限度防止ASFV傳入豬場。通過ASFV實時熒光定量PCR檢測確認進入豬場的車輛、人員和物資沒有攜帶ASFV[9-10]。

本試驗于2019—2022年監測進入豬場的車輛共608輛,其中6輛檢出ASFV核酸,這些車全部為淘汰豬運輸車。淘汰豬運輸車來自社會車輛,不由企業控制,在第1次洗消時也未經過企業監督,可能存在車輛第1次洗消不徹底,甚至未進行洗消的情況。飼料配送車、仔豬轉運車和物資配送車由養豬企業內部提供,由養豬企業人員負責和監督,清洗完畢后均拍照并上傳企業內部管理系統,由專人檢查通過后才能確定洗消完畢,最大限度切斷了傳播途徑。從不同年度來看,淘汰豬運輸車ASFV檢出率逐年下降,且在2021年和2022年均未檢測到ASFV核酸。這可能有三方面的原因:一是2019年洗消系統尚未完善,系統運行模式尚未成熟,處于摸索階段;二是公司加大了對淘汰豬運輸車司機的處罰力度,為了降低損失,司機主動加強非洲豬瘟防控知識的學習,生物安全意識逐年增強,車輛洗消的質量逐年提高;三是種豬場每月組織生產人員進行生物安全知識專題培訓和考試,考試成績作為每月績效的重要參考指標和年底職級調整的重要參考依據,促進了豬場生產人員對淘汰豬運輸車司機的督促和監督。研究發現,飼料里面也能檢測到少量ASFV核酸[11]。本試驗中監測的種豬場使用的飼料來自該企業的飼料公司,對飼料原料中ASFV核酸檢測有嚴格的要求,減少了飼料被ASFV污染的概率。

本試驗在4年間,共檢出5名進場人員ASFV核酸陽性。2019年的3名為普通飼養員和實習學生,2020年和2022年的2名為實習學生,豬場場長和技術骨干均未檢出ASFV核酸。這可能是由于普通飼養員的文化水平較低,實習學生剛剛接觸生產實踐,缺少生物安全防控理念,并且在非工作期間缺少對可能攜帶ASFV材料和豬肉等自覺遠離的觀念。隨著企業和豬場對這類人員加強教育和培訓,其生物安全意識不斷增強,ASFV檢出率逐年下降,在2021年達到進場人員ASFV零檢出的效果。

本試驗51批入場生活必需品物資中,有3批檢測到ASFV核酸,未在藥品和疫苗中檢測到ASFV核酸。養豬企業與藥品和疫苗等獸用投入品供應企業簽訂的供貨協議中要求這些投入品必須為ASFV陰性,供應企業很好地執行了這一要求。米、面和油等生活必需品雖然不是豬肉制品,但在食品供應中,不可避免與豬肉及其制品接觸。因此,在2019年和2021年的生活物資中檢測到ASFV核酸,提示對生活物資中ASFV的檢測應更加嚴格。

在洗消過程中,一些較為隱蔽的部位不容易清洗干凈。本試驗發現,某洗消10次的淘汰豬運輸車仍然能檢出ASFV,最終確認病毒來源于車輛底盤1個封閉的凹槽。把封閉凹槽的擋板卸下清洗凹槽后,再次對該車輛采樣,進行實時熒光定量PCR檢測,結果為陰性,提示在車輛洗消過程中尤其要注意隱蔽部位的洗消,同時也說明車輛洗消后進行實時熒光定量PCR檢測的重要性。

本試驗還調查了不同季節和天氣情況對ASFV檢出的影響,但未發現某一季節或某種天氣對車輛洗消效果有影響,說明車輛洗消效果的關鍵是要按照規定的標準流程進行操作。

本試驗共采集了4 120份豬血液樣品進行ASFV核酸和抗體檢測,結果均為陰性,說明通過對進入豬場的車輛、人員和物資嚴格洗消和ASFV核酸檢測,能有效阻斷ASFV傳入豬場,保證豬只不被ASFV感染,確保豬群健康。

綜上可知,通過建立種豬場的綜合洗消體系,同時聯合應用ASFV核酸檢測技術,能有效阻斷ASFV傳入豬場。本洗消體系能在不同的豬場復制,方法簡便易行,為各個豬場特別是種豬場非洲豬瘟防控提供了參考。