山羊肺源腸外致病型大腸桿菌和粘質沙雷氏菌混合感染的病原分離鑒定、毒力因子基因檢測和耐藥性分析

徐海軍,張 磊,爨淑楠,張婭菲,賈 哲,張圣堯,王書明

(1.皖西學院生物與制藥工程學院,安徽 六安 237012;2. 安徽金豐源畜牧科技有限公司,安徽 六安 237000)

大腸桿菌是一類重要的條件性病原菌。與以往主要引起腸道感染不同,近年來,腸外致病型大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)引起的畜禽腸外器官感染日漸增多,對畜牧生產的健康發展造成嚴重危脅。張召興等[1]從243份養殖場流產貉的陰道分泌物和死胎等病料組織中分離到87株ExPEC;蔣增海等[2]從河南省61家豬場送檢的病豬肺臟和肝臟等病料中分離到17株ExPEC,檢出率為27.86%;馬帥等[3]從黑龍江省和山東省不同養殖場患肺炎狐和貉的肺部分離到15株ExPEC;徐海軍等[4]從發病山羊的肺臟中分離到1株ExPEC。ExPEC攜帶多種毒力因子,致病機制復雜,引起的癥狀和病變多種多樣,給基層臨床準確診斷其感染帶來了很大困難。粘質沙雷氏菌是一種條件性致病菌。陳永林等曾報道1例山羊混合感染大腸桿菌和粘質沙雷氏菌的病例[5]。本試驗報告了1例罕見的ExPEC和粘質沙雷氏菌混合感染導致的成年山羊急性死亡,對分離菌進行致病性試驗和藥敏試驗,并對分離到的ExPEC進行了系統進化群分析和毒力因子基因檢測,以期為臨床診治該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例來源 安徽省六安市東河口鎮某養羊戶發病死亡成年山羊。

1.2 實驗動物 SPF級昆明小鼠,雄性,4周齡,購自安徽醫科大學實驗動物中心[生產許可證號:SCXK(皖)2017—001]。

1.3 主要試劑和藥品 胰大豆蛋白胨瓊脂培養基(Tryptic soybean peptone agar,TSA)、胰大豆蛋白胨肉湯和伊紅美蘭培養基,均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;藥敏紙片,購自杭州濱和微生物試劑有限公司;Taq酶、dNTP Mix和DNA Marker等,均購自 TaKaRa 公司;Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;頭孢噻呋鈉和恩諾沙星注射液,均購自安徽金豐源畜牧科技有限公司。

1.4 主要儀器 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);HGPN-II-270型隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械有限公司);HC-2518R型冷凍高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司);DYCP-31DN型DNA 電泳槽和DYY-5型穩壓電泳儀(北京六一儀器廠);2720型PCR 儀(Applied Biosystems公司);FR980型凝膠成像儀(上海復日科技儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 病史調查 2021年7月7日,六安市東河口鎮某養羊戶送檢1只剛死亡不久的成年山羊。該養羊戶共飼養了6只山羊,其中3只為1年齡大羊,另3只為小羊。養羊戶7月6日14:00時將羊群帶到附近樹林放牧,大羊用繩子系住頸部,繩子另一端拴在樹干,防止其逃跑。小羊未用繩子拴住。16:00養羊戶去察看時,發現有2只大羊已死亡,另1只大羊倒臥在地,大聲呻吟,15 min后也死亡;3只小羊表現正常。養羊戶遂帶剛死的1只大羊來就診。

1.5.2 病理剖檢觀察 對送檢的病死羊進行病理剖檢,觀察病理變化。

1.5.3 細菌分離、純化和染色鏡檢 無菌采集病死羊的肺臟組織,涂布接種于TSA平板,37 ℃培養 18 h,將長出的菌落轉接于TSA平板,37 ℃恒溫培養 18 h進行純化。將純化菌落轉接于伊紅美藍瓊脂平板上,37 ℃恒溫培養 18 h,觀察分離菌生長情況和菌落形態。對純化菌落進行革蘭染色鏡檢。

1.5.4 分離菌16S rRNA 基因PCR擴增 參照徐海軍等[4]的方法通過PCR擴增分離菌16S rRNA 基因,并進行測序和序列相似性比對鑒定。

1.5.5 致病性試驗 參照徐海軍等[4]的方法,制備濃度為 1.0×108CFU/mL 的分離菌懸液,每種分離菌取10只小鼠腹腔注射0.5 mL菌液進行攻毒,另取10只小鼠腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液,作為空白對照,測定分離菌對小鼠的致病性。

1.5.6 藥敏試驗 參照徐海軍等[4]的方法,采用紙片法測定分離菌對常用抗菌藥的敏感性。

1.5.7 防治措施 對3只小羊用藥敏試驗篩選到的敏感抗菌藥進行預防性治療,同時對羊舍加強消毒,及時清理糞便。

1.5.8 分離菌系統進化群分析和32個毒力因子基因檢測 參照參考文獻[6]合成系統進化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)和ExPEC 32個毒力基因(papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT、irp2、irp1、tsh、ler、iss、papC、kpsMTII、focD、iroN、ompA、ompT、fimH、hylA、gafD、cnf1、bmaE、cvaC、ibeA、iucD、traT、iha、nfaE和malX)的引物。參照徐海軍等[4]的方法通過PCR擴增上述基因,并進行測序和相似性比對鑒定。

2 結果

2.1 病理剖檢觀察 送檢病死山羊部分結腸腸段嚴重出血(圖1A),心內膜有散在出血斑(圖1B),瘤胃黏膜局部充血(圖1C)。其他臟器未見明顯病變。

圖1 病死山羊部分臟器病變觀察

2.2 細菌分離、純化和染色鏡檢 從病死山羊肺臟分離到很厚的灰白色菌苔(圖2A),劃線接種至TSA平板培養后長出灰白色和紅色2種菌落(圖2B)。純化培養后灰白色菌落形態特點為隆起、圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、不透明(命名為Grey0707,圖2C);紅色菌落形態特點為隆起、圓形、邊緣整齊、不透明(命名為Red0707,圖2D)。Grey0707和Red0707在伊紅美藍平板上均生長良好,菌落顏色分別呈暗紅色和黑色,均有金屬光澤(圖2E)。革蘭染色鏡檢結果顯示,Grey0707和Red0707均為革蘭陰性桿菌(圖3)。

圖2 分離菌的培養特點

圖3 分離菌革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.3 分離菌16S rRNA基因PCR擴增 Grey0707菌株 16S rRNA 基因經PCR擴增后測序,獲得長為 1 447 bp 的核苷酸片段,相似性比對結果顯示,Grey0707菌株與Escherichiacoli(E.coli) strain Pk1 (KX354348.1)和E.colistrain 1018 (MK729002.1)的16S rRNA基因序列相似性均達到99.7%。因此,判定Grey0707為埃希氏菌屬的大腸桿菌(Escherichiacoli)。

Red0707菌株16S rRNA 基因經PCR擴增后測序,獲得長為 1 439 bp 的核苷酸片段,相似性比對結果顯示,Red0707菌株與Serratiamarcescensstrain WVU-006(CP041129.1)和Serratiamarcescensstrain S3 (MK411566.1)的相似度均達到100%。因此,判定Red0707為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

2.4 致病性試驗 分離菌Grey0707攻毒后24 h,小鼠均表現精神萎靡、行動遲緩等發病癥狀,攻毒后第2、3天分別死亡8 只和1只,之后未再死亡,致死率為 90%。剖檢死亡小鼠,可見其血液暗紅,肝脾腫大;從肝臟分離到的致病菌經測序比對,與Grey0707為同一細菌。對照組小鼠表現正常,肝臟中未分離到細菌。結果表明,菌株Grey0707對小鼠有很強的致病性。同法測定Red0707的致病性,結果顯示,Red0707對小鼠無致病性。

2.5 藥敏試驗 Grey0707和Red0707的藥敏試驗結果分別見表1和表2。由表1可知,Grey0707對頭孢曲松和丁胺卡那敏感,對磷霉素中度敏感,對粘桿菌素、多西環素、新霉素、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林和紅霉素等藥物耐藥。由表2可知,Red0707對恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素和磷霉素中度敏感,對頭孢曲松、粘桿菌素、新霉素、阿莫西林、多西環素、氟苯尼考和紅霉素等藥物耐藥。結果表明,2種分離菌對常用抗菌藥的耐藥性均較嚴重。

表1 分離菌Grey0707的藥敏試驗結果

表2 分離菌株Red0707的藥敏試驗結果

2.6 防治效果 養羊戶總共才飼養了6只山羊,3只大羊都已發病死亡。根據藥敏試驗結果,建議養羊戶用頭孢噻呋鈉和恩諾沙星注射液對剩下的3只小羊進行肌肉注射預防,每天1次,連用3 d;清除羊舍中墊草和糞便,然后用消毒藥進行消毒。1周后回訪得知,3只小羊未再發病。

2.7 Grey0707系統進化群分析和毒力因子基因檢測 系統進化群分群分析結果顯示,Grey0707攜帶yjaA基因,不攜帶chuA和TspE4.C2.基因(圖4)。參照大腸桿菌系統進化性組別檢索表[7],確定該菌為A群。

圖4 Grey0707系統進化群分群基因和毒力因子基因的PCR擴增

毒力因子基因檢測結果(圖4)顯示,Grey0707攜帶外膜蛋白相關毒力基因(ompA、ompT、traT和iss)、游離鐵攝取相關毒力基因(iutA、iroN和iucD)、粘附素相關毒力基因(fimH、afa和gafD)。Johnson等[8-9]認為,ExPEC至少應具備5種毒力標記基因(papA/papc、sfa/foc、afa/dra、iutA和kpsMTII)中的2種毒力標記基因。本試驗分離到的大腸桿菌攜帶2種毒力標記基因(afa和iutA),因此可判定為ExPEC;該菌還攜帶其他多種類型的毒力因子,這可能與其致病性較強有關。

3 討論

大腸桿菌根據其不同的分子特性和致病機制被分為共生型、腸道致病型和腸外致病型三類。近些年來,ExPEC引起動物感染的報道日益增多[10-13],已成為嚴重危害養羊業健康發展的重要細菌性疾病之一[14]。本試驗分離到1株致病力特別強的ExPEC,可引起成年山羊急性突然死亡。讓人費解的是同群飼養的小羊卻未發病,實屬罕見。雖然本病例中死亡山羊肺部的眼觀病變并不明顯,但細菌分離時卻長出非常厚的灰白色菌苔,表明肺部的細菌感染非常嚴重。ExPEC大量感染時會產生大量內毒素,這可能會造成內毒素性休克,甚至快速死亡。在急性敗血癥時,由于致病因子毒力極強,可能會出現臟器無明顯病變而突然出現死亡的現象。本病例的結腸、心內膜和瘤胃黏膜有明顯病變,但其他臟器未見明顯病變,這可能反映了不同臟器對分離菌的致病作用存在耐受性差異。本試驗毒力因子檢測結果顯示,分離獲得的大腸桿菌攜帶了10種毒力因子,包括粘附素相關基因(fimH、gafD和afa)、游離鐵攝取相關基因(iroN、iucD和iutA)和外膜蛋白相關基因(ompA、ompT、traT和iss)。粘附是ExPEC感染的關鍵環節。Grey0707攜帶1種I型菌毛基因(fimH)和2種非菌毛粘附素基因(gafD和afa),可能有利于其結合腸上皮細胞,進而進入腸外組織并引起感染。動物體內游離鐵濃度很低。雖未檢測到Grey0707攜帶溶血相關基因,但其攜帶氣桿菌素鐵載體系統基因(iucD和iutA)和iroN基因,這可有效保障該菌在體內獲得充足的鐵離子用于生長。此外,Grey0707攜帶了4種外膜蛋白基因,其中ompA編碼的蛋白參與細菌的粘附、毒性、侵襲性和生物膜形成[15];traT編碼的蛋白是一種菌體外膜脂蛋白,與菌體的補體抗性和致病力關系密切[16];ompT編碼的蛋白對細菌的定植和粘附至關重要[17-18];iss編碼的蛋白與大腸桿菌的抗補體作用有關,該蛋白表達水平越高,大腸桿菌對血清的抵抗能力越強,致病力越強[19-20]?？梢?本試驗分離到的ExPEC毒力因子豐富且類型多樣,這可能是其引起本病例成年山羊迅速發病死亡的內在因素。

本病例在對分離菌進行純化培養時,發現有少量紅色菌落生長,該菌隨后被鑒定為粘質沙雷氏菌。粘質沙雷氏菌廣泛存在于環境中,在機體免疫功能下降時可引起肺部和尿道感染以及敗血癥[21-23]。在家畜上,陳永林等[5]曾報告山羊混合感染大腸桿菌和粘質沙雷氏菌的病例[5]。金紅巖等[24]從健康牦牛牛乳中分離到粘質沙雷氏菌,但對小鼠沒有致病性。本病例分離到的粘質沙雷氏菌對健康小鼠亦未表現致病作用,與其屬于條件性致病菌的特點相一致。但在有ExPEC感染的情況下,粘質沙雷氏菌可能會對大腸桿菌起到協同致病的作用,從而導致本病例中非常罕見的成年山羊突然急性死亡。

在耐藥性方面,本試驗分離到的ExPEC除對頭孢曲松、丁胺卡那和磷霉素相對敏感外,對其他抗菌藥均表現明顯的耐藥性。大腸桿菌是一種非常容易產生耐藥性的細菌。臨床上用藥時應務必根據藥敏試驗結果選擇敏感的抗菌藥進行治療。粘質沙雷氏菌的耐藥情況表現較為復雜。本試驗結果顯示,粘質沙雷氏菌(Red0707株)對恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素和磷霉素中度敏感,對頭孢曲松、粘桿菌素、新霉素、阿莫西林、多西環素、氟苯尼考和紅霉素等藥物耐藥。金紅巖等[24]從耗牛牛乳中分離到的粘質沙雷氏菌對頭孢哌酮、頭孢他啶、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、丁胺卡那、新霉素和多西環素敏感,而對慶大霉素和哌拉西林中度敏感,對頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢氨芐、氨芐西林、苯唑西林、青霉素和卡那霉素等耐藥。蘇華田等[21]從重癥監護(Intensive care unit,ICU)患者體內分離到的粘質沙雷菌對青霉素類和1、2、3代頭孢菌素類抗菌藥的耐藥率較高(>60%),對氨基糖苷類的耐藥率較高(>80%),對喹諾酮類的耐藥率較低(<30%),對頭孢吡肟和亞胺培南敏感?？梢?粘質沙雷氏菌常出現對同一類別抗菌藥物中的不同抗菌藥物表現不一致的耐藥性,但總體上看對喹諾酮類藥物較敏感。

4 小結

本試驗報道了1例罕見的ExPEC和粘質沙雷氏菌混合感染導致成年山羊突然急性死亡病例。攻毒試驗結果顯示,分離獲得的大腸桿菌對小鼠致死率為90%,粘質沙雷氏菌對小鼠無致病性。藥敏試驗結果顯示,分離獲得的大腸桿菌對頭孢曲松和丁胺卡那敏感,粘質沙雷氏菌對恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素和磷霉素中度敏感。分離到的ExPEC屬于A群,并攜帶毒力因子基因ompA、ompT、traT、iss、iutA、iroN、iucD、fimH、afa和gafD。推測ExPEC與粘質沙雷氏菌混合感染可能產生協同致病作用。家畜感染ExPEC的病例日益增多,需引起高度重視。