鐵死亡機制及其在食管癌中的作用研究*

李析濛,唐月,王濤,關徐濤,李松偉,3

1.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450046; 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450000;3.河南中醫藥大學第二附屬醫院/河南省中醫院,河南 鄭州 450002

食管癌是臨床常見的消化系統腫瘤,據統計,其在全球的發病率和死亡率分別位于各種惡性腫瘤的第8位和第6位,且我國中北部是食管癌的高發地區,發病數約占全世界的50%[1]。食管癌主要包括食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)兩個亞型,其中ESCC是最常見的組織亞型[2]。食管癌臨床常見的治療方式包括單純手術治療和新輔助化學治療,但手術治療容易伴發食道梗阻和狹窄等并發癥,新輔助化學治療容易出現腫瘤細胞的化療耐藥,治療效果并不理想[3]。因此,積極尋求治療食管癌的新的有效途徑顯得尤為必要。近年來,隨著科學研究的深入,鐵死亡(ferroptosis)作為一種新型的對鐵離子依賴的細胞程序性死亡方式,越來越受到關注[4]。研究發現,鐵死亡與癌癥的發生、發展及病情轉歸關系密切[5]。鐵死亡的激活可以對腫瘤細胞的增殖產生抑制,可能為腫瘤防治提供新的方向。本文對鐵死亡的發生機制及其與食管癌疾病進展的關系進行綜述。

1 鐵死亡概述

2003年,Dolma等[6]發現一種名為Erastin的小分子化合物,能夠以一種非凋亡的模式選擇性殺死大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus,RAS)基因突變的腫瘤細胞,而且此種死亡模式沒有出現細胞核的形態改變、DNA的斷裂以及半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)激活,caspase抑制劑對Erastin誘導的細胞死亡亦無顯著抑制作用,而脂質過氧化物抑制劑和鐵螯合劑的使用卻能發揮明顯的抑制作用。這一研究結果表明,在經典細胞凋亡模式外還存在一種全新的細胞死亡形式。2012年,Dixon等[4]首次將這種由Erastin所介導的新型調節性細胞死亡方式命名為鐵死亡。鐵死亡的主要特點為鐵依賴的高活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累和脂質過氧化物(lipid peroxide,LPO)堆積,這使細胞原有的氧化還原平衡遭到破壞,最終導致細胞死亡。鐵死亡在細胞學上表現為細胞膜喪失完整性,線粒體變小甚至消失,以及其外膜的破裂。

2 鐵死亡的調控機制

細胞鐵死亡的過程主要包括3個重要環節:鐵超載、LPO累積以及谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)活性下調。見圖1。越來越多的研究表明,鐵代謝異常、脂質代謝異常和氨基酸代謝異常是誘發鐵死亡的關鍵因素,本篇主要從這三方面對鐵死亡的調節機制進行概述。

圖1 鐵死亡調控機制示意圖

2.1 鐵代謝細胞鐵是誘導鐵死亡發生的關鍵。鐵在人體中主要以兩種形式出現,即Fe3+和Fe2+。食物中的Fe3+在胃腸道被還原為Fe2+,Fe2+在十二指腸和空腸上段被吸收。人體循環中的鐵主要是Fe3+,Fe3+與細胞膜轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TfR1)結合后進入細胞,在細胞內鐵還原酶金屬還原酶家族3(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3,STEAP3)的作用下被還原為Fe2+。二價金屬轉運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)將一部分Fe2+釋放到細胞質的動態鐵池中,余下的Fe2+由膜鐵轉運蛋白氧化為Fe3+出胞,繼續參與機體內鐵的再循環[7-8]。正常生理情況下,動態鐵池可以維持機體鐵代謝的穩定狀態。當出現鐵超載現象時,血清轉鐵蛋白接近飽和,Fe2+在細胞內積累,與H2O2反應生成羥自由基,即芬頓反應,使細胞內ROS含量升高,ROS與細胞膜上多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)發生過氧化反應,導致細胞膜結構被破壞,從而促進細胞鐵死亡[9-10]。研究發現,在RAS基因突變的鐵死亡敏感細胞中,TfR1表達增加和鐵蛋白表達降低是導致鐵超載的主要原因,鐵螯合劑脫鐵胺可以通過抑制鐵超載從而阻礙鐵死亡,而供應外源性鐵可刺激鐵死亡,沉默TFR1或使用鐵螯合劑脫鐵胺可逆轉Erastin誘導的細胞鐵死亡[11-12]。研究還發現,核轉錄因子紅細胞系相關因子-2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、熱休克蛋白B1(heat shock protein β1,HSBP1)等基因可通過限制 ROS 產生和下調TFR1介導的鐵攝取過程,從而緩解鐵過載并抑制細胞鐵死亡,進而對鐵死亡起到負性調節作用[13-14]。鐵反應元件結合蛋白2(iron-responsive element-binding protein 2,IREB2)是影響鐵代謝的主要轉錄調節因子,IREB2基因沉默后鐵蛋白受刺激而表達增加,導致細胞內鐵含量下降,進而減弱了erastin誘導的鐵死亡[4]。由此可見,對細胞鐵的攝取、貯存和利用進行調控,是鐵死亡調控的關鍵環節。

2.2 脂質代謝研究表明,LPO異常聚集是鐵死亡發生的中心環節,鐵死亡是PUFAs的磷脂過度氧化所引起的細胞死亡,PUFAs是鐵死亡中LPO積累的關鍵物質[15]。PUFAs是組成細胞膜脂質雙分子層的重要成分之一,是鐵死亡脂質過氧化的主要底物,其極易受到ROS損傷,產生強烈的氧化應激反應[16]。細胞內PUFAs的含量積聚程度將影響細胞脂質過氧化的進度,進而影響著鐵死亡發生的敏感性[17-18]。因此,脂質合成代謝異常也會間接地影響鐵死亡。研究發現PUFAs能在乙酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)和溶血磷脂酰膽堿?；D移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)這兩個關鍵酶的共同作用下生成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs),PEs是誘發細胞鐵死亡的關鍵磷脂,可繼而被一種含鐵的蛋白酶脂加氧酶氧化為LPO,過量的LPO導致細胞膜損傷,最終可觸發鐵死亡[19-21]。研究人員發現,在多種腫瘤細胞中,ACSL4和LPCAT3表達明顯升高,而且其表達水平與這些腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性呈正相關[22]。同時,ACSL4 和LPCAT3有助于鐵死亡過程中細胞內脂質過氧化物的積累,故ACSL4和LPCAT3基因敲除或功能抑制時可降低PUFAs的合成,進而增強細胞對鐵死亡的抵抗[18,23]。相反,當PUFAs 的主要代表物花生四烯酸和煙油酸鹽含量充足時,鐵死亡誘導劑erastin會使過氧化脂質增多,進而加快鐵死亡[16]。這些證據均提示脂質代謝異常對鐵死亡的發生發揮著關鍵作用,PUFAs是鐵死亡過程中脂質過氧化的重要靶點。

2.3 氨基酸代謝GPX4是一種重要的脂修復酶,也是已知的僅有的能夠直接清除LPO的酶,可以將LPO還原為脂質醇,防止LPO堆積[24]。細胞膜上存在胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(System Xc-),其為輕鏈SLC7A11和重鏈SLC3A2共同構成的異二聚體。System Xc-可使胞內的谷氨酸(glutamate)與胞外的胱氨酸(cystine)以11的比例進行交換。胱氨酸進入細胞內被還原為半胱氨酸(L-cysteine),可作為合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)的原料。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸所構成的三肽化合物,是重要的抗氧化劑,對自由基的清除和保持細胞內外氧化還原穩態起著重要作用,是GPX4降解LPO的協同分子。當GSH的合成被抑制或GPX4缺乏時,LPO發生蓄積,細胞膜被破壞,從而促進鐵死亡的發生[24]。研究證實通過對GPX4的抑制可以誘導小鼠腫瘤異種移植瘤中的鐵死亡;同時,GPX4間接失活后,細胞對鐵死亡的敏感性會增加[25-26]。由此可見,在鐵死亡調控過程中,GPX4發揮著關鍵作用。當細胞膜上的System Xc-減少或失活時,細胞無法正常攝取足量的胱氨酸,使GSH合成減少,從而促進鐵依賴的ROS的積累,進而促進了鐵死亡的發生,鐵死亡激活劑erastin和柳氮磺吡啶即是通過抑制System Xc-的活性進而發揮作用[27]。研究證實,SLC7A11的表達增加能明顯抑制鐵死亡的發生,而抑制SLC7A11的表達能顯著提高細胞對鐵死亡的敏感性[28-29];抑癌基因p53可以通過抑制SLC7A11轉錄水平的方式抑制System Xc-的功能,從而進一步調控鐵死亡[30]。由此可見,在鐵死亡的發生發展過程中,system Xc-發揮著重要作用。因此,尋找靶向GSH代謝過程的藥物,對于鐵死亡的研究意義重大。

3 鐵死亡與食管癌

近年來的研究表明,乳腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、膠質細胞瘤和前列腺癌等的發生發展都與鐵死亡有關,鐵死亡在抑制腫瘤生長和殺死腫瘤細胞方面發揮了重要作用[31-32]。鐵死亡的產生機制與細胞代謝聯系緊密,包括許多關鍵分子和信號通路,調控這些重要分子和信號通路會改變細胞對鐵死亡的敏感度。通過合理的方式誘導或控制鐵死亡,將使多種病癥得到改善,特別是惡性腫瘤。鐵死亡現象最初是在RAS突變的癌細胞中被發現的。大量發生RAS突變的不同類型的癌細胞對鐵死亡的誘導較為敏感。研究表明,RAS的激活可以通過激活TfR1和抑制膜鐵轉運蛋白(FPN)來提高細胞內鐵的攝入,同時減少細胞內鐵的外排[33-34]。簡而言之,可利用對鐵代謝這一途徑的調節,使腫瘤細胞對鐵死亡更為敏感。鐵死亡已成為許多癌癥治療藥物和手段必不可少的環節,然而,鐵死亡與食管癌相關報道仍較少。

3.1 機制方面鐵死亡是一種以細胞內鐵和ROS積累為特征的非凋亡細胞死亡,是由氧化和抗氧化系統失衡引起的氧化損傷過程。氧化應激在許多癌癥發病機制中發揮著重要作用。研究發現,ESCC患者血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶活性水平低于正常健康人群,而血清丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)水平顯著高于對照組,表明ESCC的發病與氧化應激增加和抗氧化酶活性降低有關[35],提示食管癌的發生發展與鐵死亡存在一定的關系。

NRF2是主要的細胞抗氧化和鐵代謝調節因子。研究發現,在EC組織和細胞中,NRF2顯著表達,有利于腫瘤細胞的生長[36]。同時,在ESCC活檢標本中,NRF2的表達與ESCC的化療效果和預后呈負相關,NRF2高表達的ESCC比NRF2低表達的ESCC更耐放化療,生存率更低[37-38]。Brusatol是一種靶向NRF2抑制劑,能夠顯著抑制NRF2轉錄活性并下調NRF2靶基因,促進脂質過氧化和鐵死亡,進而抑制EAC細胞生長,同時增加食管腺癌細胞對順鉑的敏感性[39]。由此進一步表明,NRF2在ESCC中具有促腫瘤作用,探究針對NRF2信號傳導的靶向治療將是NRF2高表達的ESCC治療的有效舉措。

SLC7A11是半胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白的組成部分,在腫瘤生長中起關鍵作用。在ESCC中,NRF2作為轉錄因子可刺激SLC7A11的表達上調,上調的SLC7A11有利于細胞內GSH的合成,進一步增強了對鐵死亡的抵抗力[40]。研究表明,ESCC患者中NRF2和SLC7A11在ESCC組織中過度表達,相互呈正相關,并且與較差的生存率和治療結果有關[40]。SLC7A11介導的鐵死亡抑制誘導NRF2相關的放射抗性,突出了 NRF2/SLC7A11/鐵死亡軸在未來ESCC治療中的優勢。NRF2調控的SLC7A11可通過抑制鐵死亡調節ESCC的放射敏感性[40]。目前,一些SLC7A11抑制劑已被陸續發現,如erastin、柳氮磺吡啶、順鉑等[41],SLC7A11作為EC治療靶點必將越來越受到重視。

P53是一種重要的抑癌基因,其基因突變或失活可促進細胞分裂、增殖,致使腫瘤形成。P53基因突變在EC中很常見[42-43]。P53可以通過調節氧化代謝干預癌癥中的鐵死亡[44]。最近的一項研究發現,輻射誘導的P53激活抑制了SLC7A11的表達,導致EC細胞脂質過氧化和鐵死亡[45]。

GPX4能分解小分子過氧化物并削弱脂質過氧化物毒性,防止LPO堆積,防止脂質過氧化,抑制鐵死亡[27]。HMOX1在鐵代謝調節途徑中同樣起著重要作用。人體內每天所需的鐵大部分來自血紅素分解形成的鐵。HMOX1是參與血紅素分解代謝的關鍵酶,能使血紅素分解為CO、Fe2+和膽綠素。HMOX1的激活介導鐵離子從血紅素中排出,誘導了鐵死亡的出現[46]。GPX4的上調和血紅素加氧酶(heme oxygenase 1,HMOX1)的下調是ESCC的不良預后因素[47]。

DnaJ/Hsp40同源物B亞家族成員6(DNAJB6)水平與ESCC患者淋巴結轉移呈負相關。過表達DNAJB6a在體外和體內均顯示出腫瘤抑制作用。此外,DNAJB6a的過度表達伴隨著GPX4和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白水平的顯著降低[47]。研究證實,Zeste同源物2增強子(EZH2)通過miR-125b-5p/SLC7A11軸抑制erastin誘導的ESCC細胞鐵死亡,與ESCC患者的不良預后顯著相關[48]。DNAJB6EZH2通過鐵死亡在ESCC的演變中起重要的抑癌作用。

3.2 治療方面上述研究證實鐵死亡與食管癌的發病關系密切,食管癌細胞鐵死亡的發生對食管癌的進展有抑制作用,誘導食管癌細胞鐵死亡對食管癌的防治意義重大。目前研究表明,一些鐵死亡誘導劑似乎是可行的食管癌治療手段。

最近,一種膠質毒素相關的鐵死亡途徑引起學者們的關注。膠質毒素是從海洋來源真菌煙曲霉中分離出來的次生代謝產物,已在多種癌癥中顯示出抗腫瘤特性。SUV39H1是膠質毒素靶基因,在EC組織中的表達水平高于正常組織,而在ESCC患者中的高表達水平表明預后不良。研究發現,SUV39H1通過影響鐵代謝和脂質過氧化參與鐵死亡過程,敲除或者抑制SUV39H1可以誘導鐵聚集和脂質過氧化,引發鐵死亡,進而導致癌細胞破壞[49]。研究證實,膠質毒素可通過下調ESCC細胞中SUV39H1的表達,誘導鐵死亡,進而發揮對ESSC的抗腫瘤特性[50]。

富含亮氨酸膠質瘤失活蛋白1 (leucine rich glioma inactivated 1,LGI1) 是一種神經元分泌蛋白,去整合素-金屬蛋白酶 23 (adisintegrin and metalloproteinase 23,ADAM23) 是其作用受體。相關性分析顯示,ADAM23的表達與鐵死亡相關基因GPX4、SLC3A2和SLC7A11顯著相關,過表達的ADAM23通過抑制GPX4、SLC3A2和SLC7A11促進鐵死亡。研究發現,LGI1可通過作用于ADAM23促進鐵死亡,進而抑制ESCC細胞的增殖和遷移[51]。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是一種廣泛用于癌癥治療的天然氨基酸,能通過GPX4和HMOX1誘導鐵死亡,并在ESCC中具有抗腫瘤作用[52]。該團隊證實5-ALA對ESCC有縮小腫瘤的作用,且可抑制腫瘤中GPX4的表達,并上調HMOX1的表達。鐵死亡最重要的上游調節因子是GPX4,抑制GPX4可誘導腫瘤細胞中的鐵死亡。目前,5-ALA已被臨床應用于皮膚癌的光動力療法和膀胱癌的光動力診斷,并被證明是安全的[53-54]。研究表明,5-ALA對ESCC細胞株的GPX4和HMOX1具有調節作用,可誘導鐵死亡,發揮抗腫瘤效果[52]。GPX4和HMOX1這兩個分子很可能是治療ESCC的潛在靶點,5-ALA通過對二者的調節作用或將成為一種治療ESCC的新藥。

癌干細胞是導致腫瘤發生和治療失敗的癌細胞亞群,而Hsp27在保護癌干細胞免受鐵死亡的影響中發揮重要作用。研究發現,食管癌干細胞鐵水平升高,脂質過氧化,而Hsp27可通過抑制P53上調xCT-GPX4,以保護癌干細胞免受鐵死亡,說明Hsp27和GPX4是食管癌患者重要的預后指標,靶向 Hsp27 或GPX4來阻斷這種針對鐵死亡的內在保護機制可作為ESCC中癌干細胞的潛在治療策略[55]。

克服對輻射的抵抗力是癌癥治療的主要挑戰。研究表明,硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1)是負責油酸和棕櫚烯酸形成的酶,SCD1的高表達與ESCC患者的不良生存率相關,靶向SCD1能夠誘導鐵死亡和免疫原性細胞死亡,從而提高ESCC的放射敏感性。SCD1可被視為ESCC生存的重要預后指標[56]。

有學者對鐵死亡相關基因表達情況與ESCC預后之間的關聯也做了進一步的研究,發現了一些關聯程度較高的基因,在預測ESCC預后方面具有潛在的臨床應用價值,為個性化治療提供新的選擇[57-58]。另外,鐵死亡免疫治療在EC中的運用也被報道,但其機制還有待探索[59]。

3.3 中醫藥方面目前,中醫藥被視為抗腫瘤藥物的重要組成部分,近年來研究發現中藥在抑制食管癌癌細胞增殖、促進細胞凋亡等方面發揮積極作用,與化學合成藥物相比毒副作用少、耐藥性小、遠期療效好[60]。部分中藥含有的多種活性成分通過誘導腫瘤細胞鐵死亡發揮了顯著的抗癌功效。

冬凌草甲素是傳統中藥冬凌草的主要活性成分,是一種天然的四環二萜類化合物,研究發現冬凌草甲素除了具有降壓、抗氧化、增強機體免疫力等功效外,還具有良好的抗腫瘤活性[61]。Zhang等[62]研究證實,經冬凌草甲素處理ESCC細胞TE1后,細胞內鐵離子、MDA水平和ROS呈顯著的劑量依賴性,出現脂質過氧化、細胞增殖抑制和細胞死亡,這一過程能夠被特定的鐵死亡抑制劑阻斷。冬凌草甲素通過抑制TE1細胞中的γ-谷氨酰循環,能夠使細胞內GSH/GSSG值降低,導致GPX4的酶活性顯著降低,進而誘導鐵死亡,發揮對食管癌細胞TE1的抗癌活性。

雄黃是一種含有砷化合物的中藥。研究證實,雄黃具有鎮痛、消炎、提高免疫力等作用,且對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制效果,是一種潛在的抗腫瘤藥物,已被用于治療各種類型的腫瘤,并取得了積極的效果[63]。然而,雄黃對EC的干預效果尚未完全明確。研究發現,中藥雄黃可顯著抑制EC細胞系Eca109和KYSE150細胞的增殖,還可顯著抑制Eca109和KYSE150細胞的遷移和侵襲,并影響p62、Keap1和Nrf2的mRNA和蛋白表達。作為對雄黃的反應,低p62表達抑制了Eca109和KYSE150細胞的增殖、遷移和侵襲,誘導鐵死亡。結果表明中藥雄黃可通過激活鐵死亡,抑制p62-Keap1-Nrf2途徑,進而誘導EC細胞鐵死亡并抑制其遷移[64]。

4 結語與展望

鐵死亡作為一種新型非程序性細胞死亡方式,已被證實與多種癌癥的病理生理過程密切相關。通過鐵死亡途徑干預食管癌細胞的增殖為食管癌的精準治療提供了新方法,具有一定的臨床應用價值。然而由于鐵死亡途徑的調節通路較多,食管癌的發生發展亦有其復雜性,所以目前鐵死亡在食管癌中的作用機制尚未完全明確。近年來,鐵死亡在食管癌的相關研究中已經取得了重大進展,但仍有很多問題亟待解決。例如,在食管癌中,鐵死亡與其他細胞死亡形式之間是否存在相互調控作用還有待評價;鐵死亡對食管癌的具體干預階段及靶點還需要探索;對一些預測食管癌的鐵死亡相關基因的調控機制研究得還不夠深入,與病情嚴重程度是否有關聯也未探及;目前的研究多是理論或實驗研究,真正把鐵死亡理論用于食管癌臨床治療的還很少,研究證實使用膠質毒素、LGI1、5-ALA等能夠抑制食管癌細胞的增殖和遷移,但確切機制仍有待進一步探索;目前已被證實的鐵死亡誘導劑如柳氮磺吡啶、索拉菲尼等,還有待臨床驗證。下一步從代謝、免疫和遺傳學的角度更全面地揭示和分析鐵死亡在食管癌發病中的作用機制,探尋能夠反映食管癌細胞對鐵死亡敏感的生物標記物和治療靶點,發現新的鐵死亡誘導劑并進行臨床評價,對提高食管癌診治水平關系意義重大。中藥干預鐵死亡治療食管癌的探索目前還處在起步階段,需要進一步研究。鐵死亡將成為治療食管癌的一種新策略。