FAK抑制劑PF-562271減輕老化血小板誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷

白鈺婷，剛保才，張夢潔，萬子雨，劉國權，2，顧 瑋，2

蚌埠醫科大學1癌癥轉化醫學安徽省重點實驗室，2檢驗醫學院生物化學與分子生物學教研室，安徽 蚌埠233000

輸血相關急性肺損傷（TRALI）是由輸血引起的呼吸窘迫和急性肺損傷（ALI），是目前輸血相關死亡的主要原因［1］。TRALI的臨床表現是出現呼吸困難和雙側肺水腫，病人也會出現缺氧、發熱、低血壓、心動過速和紫紺等并發癥［2,3］。TRALI的發生率為1∶5000～1∶190 000，在輸血患者中發病率約為15%［4］。TRALI可激活內皮細胞，招募和激活中性粒細胞，這些中性粒細胞會釋放活性氧，導致周圍肺組織的損傷、肺滲漏和TRALI的發展［5］。因此，探究TRALI在內皮細胞中的發生發展，可為臨床TRALI的治療提供新的理論依據。本研究在體外模擬TRALI 的發生發展，為進一步探究如何緩解TRALI造成的內皮細胞損傷具有潛在的應用價值。

黏著斑激酶（FAK）是一種蛋白酪氨酸激酶，已被發現可調節各種類型細胞的細胞粘附、運動、增殖和存活［6］。研究表明，在內毒素脂多糖（LPS）誘導的結腸上皮細胞模型中FAK被激活，表明FAK參與LPS誘導的炎癥反應［7］。FAK還增加了內皮細胞中NFκB的表達［8］。LPS可以利用FAK誘導NFκB產生炎癥反應。炎癥反應發生時，FAK對內皮細胞屏障功能的調節，發揮重要作用［9］。FAK可引起NADPH激活誘導的活性氧（ROS）表達增加［10］。內皮細胞經過氧化氫（H2O2）刺激后，細胞通透性增加，促進FAK和pFAK的表達［11］。FAK抑制劑PF-562271，可降低FAK磷酸化和體內腫瘤的生長［12］，目前正在進行I期臨床試驗。在LPS誘導的小鼠急性肺損傷（ALI）模型中，FAK抑制劑PF-573228可減輕小鼠的ALI［13］。內皮細胞屏障功能障礙導致的肺血管通透性增加是ALI的主要病理特征［14］。目前未見PF-562271在老化血小板誘導的內皮細胞損傷中的作用研究。因此，迫切需要開展進一步工作探究PF-562271對內皮細胞損傷的保護作用。

我們前期研究發現，在LPS和老化血小板誘導的TRALI小鼠模型中，FAK蛋白表達水平增高［15］。然而，抑制FAK的表達是否可以調控PECAM-1的表達，及其對內皮細胞功能的作用，目前尚無相關文獻報道。本研究旨在探討脂多糖和老化血小板對內皮細胞功能的影響，探究FAK抑制劑PF-562271在內皮損傷中的作用，為PF-562271對TRALI的治療作用提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞及試劑

人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）實驗室現有細胞庫獲取。DMEM（Gibco）；胎牛血清（Cegrogen）；7.5%SDS-PAGE 凝膠（雅酶）；PCR 試劑盒（Beyotime 和Vazyme）；ELISA 試劑盒（睿信生物）；FAK、β-actin 抗體（Proteintech）、PECAM-1（Affinity）、二抗抗體（Beyotime）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HUVEC細胞在100 mm細胞培養皿中用加入10%的胎牛血清的DMEM培養。培養箱設置為37 ℃、5%CO2。待細胞融合度達80%左右進行傳代。

1.2.2 構建人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）損傷模型 先培養HUVEC貼壁生長至70%，加入LPS預先刺激2 h后，再加入靜置5 d，濃度為1×109/mL老化的血小板共孵育6 h，最后加入PF-562271（10 μg/mL）處理24 h。

1.2.3 細胞通透性實驗 將培養至對數期的細胞用胰酶消化后，接種至Transwell-24小室內培養，并且根據實驗需要進行分組。細胞鋪滿后，將小室中的液體吸出，用PBS清洗3次，將小室內加入含有FITC標記的葡聚糖（FITC-Dextran），放置細胞培養箱孵育1 h。小室底部取出100 μL液體，用熒光酶標儀檢測吸光度。

1.2.4 跨內皮細胞電阻實驗 將HUVEC細胞用胰酶消化后制備成細胞懸液，計數并調整細胞濃度至1×105/mL，然后將200 μL的細胞懸液接種于Transwell上室中，下室加入800 μL的細胞懸液，用Millicell ERS-2 測量每個小室的基礎電阻，TEER數值按以下公式計算：TEER值（單位：Ω×cm2）=（內皮細胞電阻值-基礎電阻）×Transwell上室濾膜的底面積（0.33 cm2）。

1.2.5 RT-qPCR 實驗 Trizol 裂解細胞并提取細胞總RNA，逆轉錄后為cDNA，在PCR儀上進行實時熒光定量PCR擴增。所有引物均由生工（上海）公司合成提供（表1）。

表1 本研究使用的RT-qPCR 引物序列Tab.3 RT-qPCR primer sequences used in this study

1.2.6 Western blotting實驗 細胞處理后根據細胞量加入蛋白裂解液，在冰上進行充分裂解。細胞變性后進行蛋白電泳，300 mA轉膜1.5 h，室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1.5 h，加入曝光液后顯影。各抗體稀釋比例：FAK（1∶1000）、pFAK（1∶1000）、PECAM-1（1∶1000）、β-actin（1∶1000）、二抗（1∶4000）。

1.2.7 免疫熒光實驗 將處理好的細胞爬片，用PBS洗3遍每次3 min，再用4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS清洗3遍后用山羊血清室溫封閉30 min。一抗4 ℃孵育過夜（FAK、PECAM-1，1∶300）。次日，PBS清洗3次，與FITC二抗在室溫下避光孵育2 h，PBS清洗3遍后用含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡采集圖片。

1.2.8 活性氧檢測 將處理好的細胞用胰酶消化，根據活性氧檢測試劑盒（Beyotime）說明書操作：1000 r/min離心3 min收集細胞，棄去上清。在每管中加入1 mL帶熒光探針的培養基（DCFH-DA：不完全培養基=1∶1000）重懸細胞，置于37 ℃培養箱孵育20 min。每5 min顛倒混勻1次。再次離心棄去上清，用不完全培養基清洗3次，加PBS重懸細胞，進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.2.9 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）根據試劑盒說明書收集細胞培養上清，檢測TNF-α、IL-6和IL-8的分泌水平。酶標儀檢測各孔的吸光度A450nm，繪制標準曲線，計算各組的含量。

1.3 統計學分析

采用Graph Pad prism9.3進行統計學分析。定量資料均顯示均數±標準差，兩組間比較采用了兩獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，Ρ＜0.05時認為差異具有統計學意義。所有實驗均獨立重復3次。

2 結果

2.1 HUVEC損傷模型中，PF-562271抑制FAK、pFAK表達

免疫印記結果顯示，與LPS組相比，造模組FAK、pFAK蛋白表達增高（Ρ＜0.01）。加入PF-562271后，FAK和pFAK 蛋白表達水平顯著降低（Ρ＜0.05，圖1A～C）。RT-qPCR結果顯示，與LPS組相比，造模組FAK相對表達量增加（Ρ＜0.01），加入PF-562271后，FAK表達顯著降低（Ρ＜0.01，圖1D）。

圖1 PF-562271抑制FAK、pFAK表達Fig.1 PF-562271 inhibits FAK and pFAK expression in cultured HUVECs. A-C:Western blotting for detecting changes in FAK and pFAK protein expressions.D:RTqPCR for FAK mRNA expression.Data are presented as Mean±SD (n=3).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 HUVEC 損傷模型加入PF-562271 后，FAK 表達減少

免疫熒光結果顯示，與LPS組相比，造模組FAK的平均熒光強度增高（Ρ＜0.05），加入PF-562271后，FAK的平均熒光強度降低（Ρ＜0.01，圖2）。

圖2 免疫熒光檢測FAK表達減少Fig.2 Expression of FAK protein in the treated HUVECs detected by immunofluorescence staining(Original magnification:×40).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 PF-562271改善內皮細胞屏障功能和通透性

ROS結果顯示，與對照組相比，LPS組和造模組都會導致ROS 的增加，造模組ROS 的相對熒光強度為155.86（Ρ＜0.001），而加入PF-562271后，ROS降低，此時ROS的相對熒光強度為100.64（Ρ＜0.001，圖3A、B）。通過測量跨內皮細胞電阻（TEER）來確定細胞的屏障完整性。結果顯示，與對照組相比，造模組TEER值降低（Ρ＜0.01），加入PF-562271后，TEER值增高（Ρ＜0.01，圖3C）。通過測量FITC-dextran在Transwell小室培養的內皮細胞的滲透量分析細胞的通透性。結果顯示，與LPS組相比，造模組細胞的FITC-dextran的滲透量增高（Ρ＜0.01），加入PF-562271 后滲透量降低（Ρ＜0.05，圖3D）。

圖3 PF-562271對內皮細胞屏障功能和通透性的影響Fig.3 Effect of PF-562271 on barrier function and permeability of HUVECs with different treatments. A, B: Changes in ROS levels. C: Changes in TEER levels. D: Changes in cell permeability.Data are presented as Mean±SD(n=3).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 PF-562271抑制內皮細胞炎性因子表達

通過RT-qPCR檢測內皮細胞中炎癥因子的表達，結果顯示與對照組相比，TNF-α、IL-6、IL-8表達相對增高（Ρ＜0.001），加入PF-562271后，TNF-α、IL-6、IL-8表達下降（Ρ＜0.05，圖4A～C）。通過ELISA檢測內皮細胞炎性因子的蛋白表達，結果顯示與對照組相比，TNF-α、IL-6、IL-8 表達增高（Ρ＜0.01），加入PF-562271 后，TNF-α、IL-6、IL-8表達下降（Ρ＜0.01，圖4D～F）。

圖4 PF-562271抑制TNF-α、IL-6、IL-8 的表達Fig.4 PF-562271 inhibits the expression of TNF-α,IL-6 and IL-8.A-C:TNF-α,IL-6 and IL-8 mRNA levels detected using RT qPCR.D-F:TNF-α,IL-6 and IL-8 protein levels detected using ELISA.(Mean±SD,n=3).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 HUVEC 損傷模型中，PF-562271 抑制PECAM-1表達

免疫印記結果顯示，與LPS 組相比，造模組PECAM-1蛋白表達增高（Ρ＜0.05），加入PF-562271后，PECAM-1表達水平降低（Ρ＜0.05，圖5A、B）。RT-qPCR結果顯示，與LPS組相比，造模組PECAM-1表達水平增高（Ρ＜0.01），加入PF-562271后，PECAM-1表達水平降低（Ρ＜0.01，圖5C）。

圖5 PF-562271抑制PECAM-1表達Fig.5 PF-562271 inhibits PECAM-1 expression in cultured HUVECs. A-B: Western blotting for PECAM-1 protein expression changes.C:RT-qPCR for PECAM-1 mRNAexpression changes.Data are presented as Mean±SD(n=3).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 HUVEC損傷模型加入PF-562271后，PECAM-1表達減少

免疫熒光結果顯示，與LPS 組相比，造模組中PECAM-1 的平均熒光強度增高（Ρ＜0.01），加入PF-562271 后，PECAM-1 的平均熒光強度降低（Ρ＜0.01，圖6）。

圖6 免疫熒光檢測PECAM-1表達降低Fig.6 Immunofluorescence staining of PECAM-1 expression in HUVECs with different treatments(×40).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.7 HUVEC損傷模型中，維生素C降低PECAM-1表達

免疫熒光結果顯示，與LPS 組相比，造模組PECAM-1的平均熒光強度增高（Ρ＜0.01）。加入ROS抑制劑維生素C 后，PECAM-1 的平均熒光強度降低（Ρ＜0.01，圖7）。

圖7 加入維生素C后，免疫熒光檢測PECAM-1蛋白表達降低Fig.7 Vitamin C decreases PECAM-1 protein expression in HUVECs with different treatments detected by immunofluorescence staining(×40).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖、高血壓、急性肺損傷等疾病的主要促成因素［19］。血管內皮損傷機制受多種因素影響，如氧化應激、氧化低密度脂蛋白和炎癥反應等［20］。在TRALI進展過程中，內皮細胞屏障功能受損，活化的內皮細胞釋放趨化因子，激發中性粒細胞，高反應性的中性粒細胞會與肺內皮細胞發生黏附［21］。中性粒細胞被激活并釋放ROS，會損壞內皮細胞并導致血管滲漏，引發TRALI?；凇岸未驌簟崩碚摚?7］，我們選擇脂多糖和老化血小板來建立內皮細胞損傷的體外模型。通過前期構建的TRALI小鼠模型，提取小鼠肺組織檢測炎性因子的表達，結果顯示TNF-α、IL-6、IL-8在模型組中顯著增高，表明肺部已產生較為嚴重的炎癥反應。與此同時，為了在體外驗證TRALI的發生發展，我們將人臍靜脈內皮細胞用脂多糖和老化血小板刺激建立內皮細胞損傷的體外模型。觀察到ROS增加，TEER值降低，細胞通透性增高，說明此時內皮細胞屏障受損。造模組中TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著增高，這與體內實驗的結果一致。綜上所述，本研究成功構建體外TRALI內皮細胞損傷模型。

FAK 是一種非受體酪氨酸蛋白激酶，具有高度保守性，可調節包括內皮細胞在內的細胞的遷移、侵襲、轉移和存活［22］。研究表明，在類風濕性關節炎中，FAK可以通過整合素β3增加滑膜血管生成［23］。在ALI中，FAK可通過Rho GTP酶信號轉導，破壞內皮細胞屏障［24］。因此，內皮細胞中的FAK被認為是類風濕性關節炎炎癥和ALI血管通透性的重要決定因素。FAK還可調節活性氧誘導的內皮細胞屏障破壞，NADPH氧化酶的激活和ROS的生成被確定為損傷內皮細胞的重要介質［25］。這些發現表明，FAK在內皮細胞中發揮了重要作用。在我們構建的脂多糖和老化的血小板誘導的內皮細胞損傷模型中，造模組FAK的mRNA和蛋白表達水平均升高，且細胞內ROS含量上升。我們的研究結果與FAK在ALI中的結果是高度一致的。在LPS誘導的ALI小鼠模型中，FAK抑制劑PND-1186可抑制巨噬細胞產生的炎癥反應［26］。另一種FAK抑制劑PF-562271可抑制FAK的磷酸化，緩解內皮細胞屏障功能損傷，從而減輕LPS誘導的小鼠ALI［27］。本研究發現，脂多糖和老化血小板刺激HUVEC，TEER值降低，提示內皮細胞的屏障完整性受損。而PF-562271增加TEER值，內皮細胞屏障完整性得到改善。測定細胞的通透性時，我們發現脂多糖和老化血小板刺激HUVEC，可增加內皮細胞的通透性，加入PF-562271后，內皮細胞通透性降低。檢測FAK在造模組中的表達，發現FAK和pFAK在造模組中表達水平升高，加入PF-562271后，FAK和pFAK表達水平降低，表明FAK抑制劑在內皮細胞損傷模型中同樣能抑制FAK蛋白的表達及其磷酸化。

血小板－內皮細胞黏附分子-1（PECAM-1），也稱為CD31，是內皮細胞與細胞連接處的黏附分子免疫球蛋白超家族的成員［28］。PECAM-1在血管生成中起主要作用，在炎癥和血栓應激下維持血管完整性，并調節白細胞跨內皮遷移［29］。研究表明，針對PECAM-1的單克隆抗體可阻斷急性炎癥，以應對各種刺激［30］。在內毒素誘導的角膜炎模型中，阻斷PECAM-1可以抑制中性粒細胞募集并防止內毒素誘導的角膜渾濁度增加［31］。在DSS誘發的結腸炎模型中，阻斷PECAM-1可以減少白細胞遷移并降低疾病嚴重程度［32］。在糖原誘導小鼠腹膜炎的模型，阻斷PECAM-1可以防止中性粒細胞聚集到腹膜腔中［33］。PECAM-1敲除小鼠表現出中性粒細胞浸潤減少［34］，而在異物炎癥中，缺乏PECAM-1導致血管生成減少而減輕炎癥［35］。因此，PECAM-1在炎癥中發揮重要作用，可以促進白細胞跨內皮遷移。在子宮癌細胞模型中用FAK 抑制劑（GSK2256098）治療腫瘤，PECAM-1蛋白表達降低，細胞增殖減少并增加細胞凋亡率［36］。我們推測，FAK抑制劑可能通過PECAM-1來緩解內皮細胞損傷。本研究結果表明，內皮細胞被脂多糖和老化血小板刺激后，PECAM-1 表達升高，加入FAK抑制劑PF-562271后，PECAM-1表達水平降低。但是FAK與PECAM-1之間的具體調控機制還不清楚，有待于進一步研究。在雌二醇誘導的血管內皮細胞損傷模型中，可以通過敲低FAK，提高細胞活力同時又抑制ROS的水平［37］。而在香煙煙霧引起血腦屏障內皮細胞炎癥的模型中，應用抗氧化劑維生素C（抗壞血酸）時，可以發現炎性因子IL-6、IL-8的釋放減少，PECAM-1表達水平降低和單核細胞－內皮細胞的黏附減弱［38］。在易發生卒中的大鼠模型中，維生素C和維生素E可減少氧化應激，改善血管功能和結構，并防止高血壓的進展［39］。本研究結果表明，脂多糖和老化的血小板可以促進ROS的釋放，加入FAK抑制劑PF-562271后可以減少ROS 的釋放。在造模組中，加入維生素C 后，PECAM-1的熒光強度降低。我們發現FAK抑制劑可通過PECAM-1來抑制ROS的釋放。為了進一步確定PECAM-1 在炎癥狀態下的作用，我們后續可考慮用siRNA 抑制內皮細胞PECAM-1 的表達，進一步驗證FAK與PECAM-1的調控機制，探究PECMA-1對內皮細胞功能的影響。

綜上所述，本研究發現脂多糖和老化血小板可構建內皮細胞損傷的模型，FAK抑制劑PF-562271可通過改善氧化應激水平和降低炎癥反應來緩解內皮細胞損傷。為進一步探索FAK抑制劑PF-562271調節內皮細胞損傷的機理提供了理論依據，為PF-562271對TRALI的治療作用提供了研究基礎。