竹節參總皂苷緩解CCl4誘導的大鼠急性肝損傷：基于調控PI3K/Akt/NF-κB信號通路

吳廣陽，宋添力，唐 浪，王一民，劉 緒，黃 勝

湖北民族大學1醫學部，3風濕性疾病發生與干預實驗室，湖北 恩施 445000；2湖北恩施學院，湖北 恩施445000

急性肝損傷（ALI）是指在短期內由各種原因引起的突發性的肝功能異常的疾病。藥物、病毒、免疫損傷等是ALI的發病原因；氧化應激、炎癥反應、細胞纖維化、細胞凋亡等是其發病機制［1,2］。全球2/3以上的ALI發生在亞太地區［3］。近年來，急性肝損傷的發病率呈逐年上升趨勢且伴有多種嚴重并發癥，嚴重威脅人類的身體健康［4］。由于急性肝損傷的病理機制復雜，目前國內外尚無理想的急性肝損傷治療方案，臨床上治療原則主要包括對因治療、使用保肝降酶和利膽退黃藥物以及最新的納米技術［5,6］；對于嚴重的急性肝損傷患者，肝臟部分切除術和肝移植仍是臨床上的首選診療手段，但存在供體不足、免疫抑制、手術預后情況較差等問題，每年接受手術的病人不到40%，在一定程度上限制了其臨床應用［7,8］。近年來許多專家學者通過對急性肝損傷發病機制的不斷深入研究，也逐漸把目光移向祖國傳統醫學，以期在中醫藥治療方面有所突破，從中研發出起效快、多靶點、副作用小的抗急性肝損傷的新藥，而位于恩施州的湖北民族大學附屬醫院經常運用民族藥材竹節參治療肝炎、肝癌等肝病，臨床作用顯著。因此，闡明竹節參治療急性肝損傷的發病機制，尋找安全、療效確切的防治急性肝損傷的新策略、新藥物意義重大。

竹節參是五加科植物竹節參的干燥根莖。其性溫，味甘、苦，具有補虛強壯，散瘀止血、止痛的功效，多用于素體羸弱，咳嗽痰多，風濕疼痛等疾?。?］。我國土家族地區極具特色的復方竹節參片則是以竹節參為主藥，通過網絡藥理學分析得出，其通過作用于STAT3、JUN 和AKT1 等核心靶點，參與相關生物進程及通路的調節，進而發揮對ALI的抗氧化、抗炎、護肝等治療作用［10］。竹節參總皂苷（TSPJ）為是竹節參的主要成分，邱玲等［11］實驗研究表明竹節參總皂苷可以通過p62相關的Nrf2通路和AMPK-ACC/PPAR α軸減輕肝脂肪變性。曾楚華等［12］研究竹節參總皂苷對BV-2小膠質細胞神經炎癥模型p38 MAPK/NF-κB通路的影響，發現竹節參總皂苷可通過抑制此通路以改善神經炎癥，并抑制細胞遷徙。鄧旭坤等［13］研究表明竹節參皂苷可能通過減少肝細胞的凋亡和炎癥來抵抗APAP誘導的肝損傷。以上已有相關研究證明竹節參總皂苷在抗炎、抗氧化應激、抗凋亡方面具有一定藥理作用，然而目前還沒有TSPJ在干預CCl4誘導的大鼠肝損傷方面的研究和報道，尤其是在急性肝損傷中保護肝臟方面的作用機制尚需進一步研究探究［14］。

本課題組前期研究發現［15］，竹節參多糖可減輕炎性細胞因子和凋亡蛋白表達，從而對ALI 大鼠產生保護作用，其作用可能與抑制PI3K/AKT/NF-κB通路活化有關。本文通過現代生物信息學得出，竹節參皂苷對ALI具有較好的保護作用，核心通路為PI3K/Akt/NF-κB；通過文本挖掘發現在ALI疾病中，核轉錄因子-κB（NF-κB）被認為是關鍵的炎癥因子。因此，本研究通過進一步分析PI3K/Akt/NF-κB通路相關蛋白的表達水平，闡釋竹節參總皂苷對CCl4致ALI的保護作用及其分子機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，SPF級，6周齡，體質量200±20 g，共50只，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物質量合格證編號：No.210726210100 500171；許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物實驗方案經湖北民族大學倫理委員會批準（2021-50），所有實驗程序均按照中國國家衛生研究院的實驗動物護理和使用指南進行。

1.2 竹節參總皂苷制備及含量測定

竹節參于湖北省宣恩縣椿木營基地購買，經湖北民族大學醫學院曾楚華副教授鑒定為竹節參。將200 g竹節參制成粗粉，按質量體積比1∶10比例加入60%的乙醇，浸泡2 h，然后水浴回流，回流時間2 h，過濾得濾液，重復3次，將3次濾液合并，旋轉蒸發回收乙醇，減壓濃縮至一定體積，配制成竹節參：濃縮液為1∶1的溶液。上已處理好的大孔樹脂柱，上柱后先用水洗脫、然后用60%的乙醇洗脫。合并乙醇洗脫液，65 ℃減壓干燥，得到竹節參總皂苷［16］，提取率為14.6%，用香草醛-冰醋酸-濃硫酸測定方法測定［17］，后獲得29.2 g精制竹節參總皂苷，竹節參總皂苷的含量為91.81%。

1.3 主要試劑

聯苯雙酯（北京協和藥廠）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體、白細胞介素-6（IL-6）抗體（萬類生物），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）（proteintech），沉默信息調節因子6（SIRT6）、磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）抗體（abcam），磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-AKT）抗體（萬類生物），絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT，SAB）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）抗體、核因子κB（NF-κB）抗體（萬類生物）。

1.4 主要儀器

全自動生化檢測儀（深圳雷杜生命科技）；多功能酶標儀（Thermo）；組織切片機（LEICA）；正置光學顯微鏡（Nikon）；電泳及轉膜系統（Bio-Rad）；凝膠成像系統（Thermo）；高精度天平（北京賽多利斯科學儀器）；高速冷凍離心機（Eppendrof）。

1.5 竹節參治療肝損傷的網絡藥理學分析

利用TCMSP、Swiss Target Prediction數據庫提取竹節參的化合物組成、化合物靶點關系（以Swiss Target Prediction生物利用度評分高，胃腸道吸收高為標準）。將交集靶點導入STRING網站，得到PPI網絡圖，將TSV文件導入R語言V4.0.3軟件，得到PPI統計圖。在R語言V4.0.3 軟件中安裝“RSQLite”“org.Hs.eg.db”程序包，將竹節參的交集靶點名轉換為對應的基因ID；利用“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，基于基因ID分別進行GO、KEGG富集分析。

1.6 動物造模及分組給藥

將50只SD大鼠適應性喂養1周，1周后進行實驗分組，隨機分為6組，分別為正常組（Control）、模型組（CCl4）、聯苯雙酯組（LBSZ，100 mg/kg）、竹節參總皂苷低、中、高（50、100、200 mg/kg）劑量組，每組8只。造模方式參考文獻［18］：采取急性肝損傷間隔誘導法建立肝損傷大鼠模型，除正常組腹腔注射12%的橄欖油混懸液外，其余各組大鼠在第1、4、7天時腹腔注射12%的CCl4橄欖油混懸液，注射體積均為5 mL/kg。此期間除正常組、模型組大鼠給予雙蒸水灌胃外，其余各組大鼠給予相應的藥物劑量灌胃，各組灌胃體積均為5 mL/kg。第7天各組大鼠給予相應的腹腔注射處理及灌胃后，晚上禁食不禁水，次日（＞12 h）麻醉后收集大鼠血清與肝臟組織。

1.7 樣本的采集及處理

稱取體質量并記錄，用20%的烏來糖（0.6 mL/100 g）行大鼠腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后即行取材。（1）取血清：收集血液，離心（4 ℃，4000 r/min，15 min），分離血清，-80 ℃保存；（2）取肝組織：取肝臟，放在4 ℃生理鹽水中洗凈，除去表面結締組織，用濾紙吸干后稱取質量。

1.8 觀察及檢測指標

1.8.1 血清AST、ALT、TBil、ALP水平測定 使用全自動生化儀檢測各組大鼠血清中ALT、AST、TBil、IBil 水平。

1.8.2 肝組織病理學觀察 大鼠肝組織經多聚甲醛固定24 h后，脫水、包埋，制作石蠟切片（5 μm），HE 染色，鏡下觀察細胞形態結構無異常，周圍肝細胞索排列情況，是否可見融合性壞死，空泡樣病變。

1.8.3 肝臟組織SOD、GSH-Px、MDA 水平測定 大鼠肝組織與生理鹽水以1∶9的比例制成10%的肝組織勻漿，4 ℃條件下以轉速10 000 r/min 離心5 min并保留上清液，依據各試劑盒說明書分別測定各組MDA 及SOD、GSH-Px的水平。

1.8.4 免疫組化檢測大鼠肝臟p-NF-kB蛋白的表達 通過烤片1 h，溫度為60 ℃，經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水后，進行抗原修復，加5%H2O2進行內源性過氧化物酶淬滅處理10 min，滴加5%BSA濕盒中封閉30 min；一抗孵育：滴加一抗（p-NF-kB工作濃度為1∶200）4 ℃孵育過夜；二抗孵育：加二抗，濕盒在37 ℃烘箱中避光孵育1 h。二氨聯苯胺（DAB）染色鏡下觀察，蘇木素復染，0.5%鹽酸乙醇分化3 s，飽和碳酸鋰返藍40 s，然后脫水，透明，中性樹脂封片，然后顯微鏡下觀察拍照。用Image J軟件分析各組的相對陽性表達面積。

1.8.5 蛋白免疫印跡實驗檢測PI3K-Akt、SIRT6-NF-KB相關通路蛋白 預先購買的PMSF需放置在-20 ℃冰箱，Riapa強裂解液4 ℃冰箱保存，將所需試劑和待勻漿組織拿出放入冰盒中，4×buffer需要先放在水浴鍋中讓結晶熔化后經過勻漿、變性、超聲等進行BCA蛋白樣品測定，然后配置分離膠和濃縮膠后，每個加樣孔加5 μL樣品，最后一孔加入2 μL預染的Marker 以分辨蛋白分子量大小，加樣完成，進行電泳、轉模。轉膜完成，用5%脫脂牛奶進行封閉1 h，與一抗結合，4 ℃靜置過夜。一抗孵育完成，從4 ℃冰箱中取出，滴加二抗，搖床孵育1 h，TBST 洗完膜后進行顯影即可，最后用ImageJ軟件分析帶灰度值。

1.9 統計學分析

使用統計軟件SPSS 22.0分析結果，數據以均數±標準差表示，單因素方差分析用于組間比較，Ρ＜0.05表示差異有統計學意義，利用Graphpad prism9.0做圖，具體實驗方法參考文獻［19］。

2 結果

2.1 竹節參治療肝損傷的網絡藥理學分析

竹節參含有15種有效化合物，包括皂苷、總皂苷、黃酮類等，對應靶點數259個，靶點排名較前的化合物為竹節皂苷Ⅳa、人參皂苷等。PPI統計發現排名較前的蛋白為Akt1、VEGFA、CASP3等（圖1）。

圖1 竹節參治療肝損傷的GO、KEGG富集分析Fig.1 GO and KEGG enrichment analysis of treatment of liver injury with Panax japonicus.

2.2 TSPJ對ALI大鼠血清AST、ALT、ALP、TBil的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、ALP、TBil顯著增高（Ρ＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠血清AST、ALT、ALP、TBil顯著降低（Ρ＜0.01，圖2）。

圖2 TSPJ對ALT、AST、ALP、TBil水平的影響Fig.2 Effect of total saponins of Panax japonicus on serum ALT,AST,ALP and TBil levels in rats with CCl4-induced liver injury.##P＜0.01 vs Control,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.3 TSPJ對ALI大鼠肝臟組織病理學變化的影響

正常組大鼠肝組織細胞形態結構無異常，也沒有出現炎性細胞浸潤的情況，周圍肝細胞索以中央靜脈為中心，呈放射狀排列（圖3A）。模型組大鼠肝臟細胞可見融合性壞死，空泡樣病變，肝門區形態結構紊亂，肝細胞索消失（圖3B）。與模型組相比，各給藥組有不同程度的好轉，大鼠肝臟組織壞死有不同程度的減輕，空泡樣病變減少，肝索形態結構相對改善（圖3C～F）。

圖3 各組大鼠肝臟病理學變化Fig.3 Pathological changes of the liver in each group(HE staining,original magnification: ×200).A:Control;B:CCl4;C:LBSZ;D:TSPJ/50 mg·kg-1;E:TSPJ/100 mg·kg-1;F:TSPJ/200 mg·kg-1.The arrows indicate fusion necrosis(→),vacuolike lesions(↓),and confluent areas(←).

2.4 TSPJ對ALI大鼠肝臟組織的MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

與正常組相比，模型組SOD、GSH-Px水平顯著降低（Ρ＜0.01）；與模型組比較，各給藥組SOD和GSH-Px活性水平均有不同程度的升高（Ρ＜0.01，圖4A、B）。與正常組相比，模型組大鼠肝臟MDA水平顯著升高（Ρ＜0.01，圖4C），與模型組比較，各給藥組肝臟MDA水平有不同程度的降低（Ρ＜0.01，圖4C）。

圖4 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝組織SOD(A)、GSH-PX(B)和MDA(C)水平的影響Fig.4 Effect of total saponins of Panax japonicus on SOD(A)、GSH-PX(B)and MDA(C)levels in liver tissue of rats with CCl4-induced liver injury.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.5 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝臟組織p-NF-κB蛋白表達的影響

正常組大鼠肝組織細胞內未見p-NF-κB表達陽性（圖5 A）；與正常組比較，模型組中p-NF-κB陽性表達則明顯增加，陽性細胞數增多（Ρ＜0.01，圖5B）；與模型組比較，經給藥治療干預后，各給藥組肝組織內p-NF-κB的相對陽性細胞數減少（Ρ＜0.01，圖5C～G）。

圖5 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝組織p-NF-κB表達的影響Fig.5 Effect of total saponins of Panax japonicus on expression of p-NF-κB in the liver tissue of rats with CCl4-induced liver injury.A:Control;B:CCl4;C:LBSZ;D:TSPJ/50 mg·kg-1;E:TSPJ/100 mg·kg-1;F:TSPJ/200 mg·kg-1.G:Bar-chart.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.6 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝臟PI3K/Akt蛋白表達的影響

相對于空白組，模型組PI3K、p-PAkt蛋白的表達水平顯著下降，p-NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白的表達水平顯著升高（Ρ＜0.05）；與模型組相比，藥物干預組PI3K、p-Akt蛋白的表達水平顯著升高，p-NF-κB p65、TNF-α與IL-6的蛋白的表達水平顯著降低（Ρ＜0.05，圖6）。

圖6 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝組織PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達的影響Fig.6 Effect of total saponins of Panax japonicus on expressions of PI3K,p-Akt and Akt in rat liver tissues with CCl4-induced liver injury(Mean±SD,n=3).##P＜0.01 vs Control,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.7 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝臟p-NF-κB/NF-κB蛋白表達的影響

相對于空白組，模型組p-NF-κB p65蛋白的表達水平顯著升高（Ρ＜0.05）；與模型組比較，藥物干預組p-NFκB p65蛋白的表達水平顯著降低（Ρ＜0.05，圖7）。

圖7 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝組織p-NF-κB、NF-κB表達的影響Fig.7 Effect of total saponins of Panax japonicus on expressions of p-NF-κB and NF-κB in liver tissue of rats with CCl4-induced liver injury.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

2.8 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝臟TNF-α、IL-6蛋白表達的影響

相對于空白組，模型組TNF-α、IL-6蛋白表達水平顯著升高（Ρ＜0.05）；與模型組比較，TSPJ組TNF-α、IL-6蛋白表達水平有不同程度降低（Ρ＜0.05，圖8）。

圖8 TSPJ對CCl4致ALI大鼠肝組織TNF-α、IL-6表達的影響Fig.8 Effect of total saponins of Panax japonicus on expressions of TNF-α and IL-6 in the liver tissue of rats with CCl4-induced ALI.##P＜0.01 vs Control;*P＜0.05,**P＜0.01 vs CCl4 group.

3 討論

中醫認為，肝損傷的主要病因病機為“瘀”“毒”“虛”，在治療方式上可用活血化瘀、祛邪扶正的方法進行干預。竹節參作為土家族的著名民族藥物，被土家族先民譽為“草藥之王”［20,21］，其活血化瘀、補虛強壯的功效也較為符合肝損傷的病機和祛邪扶正的用藥原則。本課題組前期實驗研究表明［22］，竹節參具有多種生物活性，其中竹節參多糖可激活Nrf2-ARE信號通路，增強機體的抗氧化酶系表達，減輕CCl4引起的氧化損傷。研究表明［23,24］，竹節參含有皂苷類、糖類、氨基酸、揮發 油、無機元素等成分，其中皂苷類和糖類是其主要的化學成分。熊海容等［25］研究竹節參皂苷Ⅳa對于脂肪性肝炎的干預作用，結果表明竹節參皂苷Ⅳa 可以通過CD36-NLRP3信號通路降低脂質沉積與改善肝臟炎癥,為脂肪性肝病的治療提供新的思路。竹節參總皂苷可通過TLR4/NF-κB信號通路改善自然衰老大鼠脂肪組織炎癥。竹節參總皂苷有減少炎癥相關因子的藥理活性，提高過氧化物酶系統活力的作用［26］，可能是發揮肝保護作用的基礎，所以竹節參總皂苷對肝損傷可能有較好的治療作用。

為了闡釋竹節參總皂苷對CCl4致急性肝損傷的保護作用及其分子機理。課題組首先通過生物信息學篩選出竹節參中含有多種皂苷類活性化合物，結果表明，對ALI具有較好的保護作用，核心靶蛋白為AKT1，排名第一的信號通路為PI3K/Akt，提示竹節參總皂苷可能是通過調節PI3K-Akt信號通路發揮緩解ALI的作用。PI3K是磷脂酶激酶家族的成員，其成員具有脂肪酶和蛋白激酶活性［27］。PI3K-Akt信號通路的作用機制為磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）特異性催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化［28］并通過與蛋白激酶B（Akt）N末端的PH結構域結合來激活3-磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）。PDK-1和PDK-2分別磷酸化Akt中的Thr308和Ser473，Akt被磷酸化并被激活，進一步調節靶基因［29］。PI3K/Akt信號轉導已成為細胞中重要的信號轉導途徑，對細胞增殖、存活、凋亡、代謝、和免疫反應具有顯著影響［30］。研究表明［31］，AMPK/PI3K/AKT介導的氧化應激促進肝臟駐留巨噬細胞促炎反應，從而加劇了APAP誘導的急性肝損傷。WU等［32］發現，急性肝損傷中的AKAP12缺失激活了PI3K/AKT磷酸化信號通路，誘導PCSK6及其下游炎癥相關基因的表達增加，并促使巨噬細胞產生大量的炎癥因子，因此，PI3K/Akt通路與急性肝損傷密切相關［33,34］。

此外，通過文本挖掘發現抗炎抗氧化在ALI等疾病的治療中倍受重視，其中核轉錄因子-κB（NF-κB）被認為是關鍵的炎癥因子。當炎癥在肝臟發生時，NF-κB乙?；?，從而下游炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6開始轉錄，導致炎癥因子加速釋放和炎癥介質加快合成。

為了確定竹節參總皂苷是否對CCl4導致大鼠肝損傷有治療作用，通過HE染色和免疫組化提示TSPJ降低p-NF-κB的含量發揮抗炎的作用。然后提取肝組織的總蛋白后對目的蛋白進行檢測并比較各組之間目的蛋白總含量的相對變化，實驗結果提示，相對于空白組，模型組PI3K、p-PAkt水平減少，p-NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白的表達水平提高，表明模型組的肝損傷較嚴重。而竹節參總皂苷中、高劑量組中的PI3K、p-Akt蛋白的表達水平明顯升高，p-NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白的表達水平降低，提示竹節參總皂苷治療組在治療過程中可能增加機體PI3K、p-Akt的合成及儲備能力，使之基礎水平得到提升，在面對炎癥因子攻擊時更有能力去充分地應對，抑制炎癥因子p-NF-κB、TNF-α、IL-6的表達，從而減輕CCl4持續性誘導的肝臟損傷。另外，HE染色和免疫組化提示TSPJ降低p-NF-κB的含量發揮抗炎的作用。

綜上所述，竹節參總皂苷通過作用于PI3K/Akt/NF-κB信號通路發揮對CCl4所致肝損傷的抗炎及抗氧化作用，進而減輕了肝臟炎癥與氧化損傷。該研究不僅揭示了竹節參總皂苷保護肝損傷作用機制，亦為靶向NF-κB的抗炎護肝研究提供了實驗依據。