吡非尼酮聯合PD-L1抑制劑抑制小鼠異位膀胱腫瘤的生長

陳守峰，張舒超，樊偉林，孫 巍，劉貝貝，劉建民，郭園園

蚌埠醫學院第一附屬醫院泌尿外科，安徽 蚌埠233040

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤［1］，其發病率和死亡率一直居高不下且逐年升高［2］。目前，轉移性膀胱癌的標準一線治療仍為基于順鉑的全身化療，其總生存期（OS）僅為13～15個月，不耐受順鉑條件的患者中，以卡鉑為基礎的化療的中位OS僅為8～9個月，且5年總體生存率＜10%［3］化療方式局限，化療效果欠佳是目前膀胱腫瘤治療急需解決的問題。以程序性死亡受體-配體1（PD-L1）抑制劑為代表的免疫檢查點抑制劑（ICIs）因其對腫瘤微環境（TME）的明顯作用成為膀胱腫瘤新的治療方案［4］。盡管ICIs療法實現了相對較長時間的腫瘤緩解，但只有不到30%的膀胱腫瘤患者從中受益，這使得ICI 的臨床應用明顯受限［5,6］。髓源性抑制細胞（MDSCs）作為一種表型異質細胞群，可誘導T細胞功能障礙并減少其增殖，從而促進細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）細胞凋亡［7］。因此，調節PD-L1在腫瘤細胞上的表達，緩解TME促進CTL的浸潤，對于提高PD-1/PDL1 ICB治療的反應率至關重要。

吡非尼酮（PFD）是一種通過下調TGF-β信號傳導達到廣譜抗纖維化作用的吡啶酮類化合物，能夠防止和逆轉纖維化和瘢痕形成［8］，已獲批用于特發性肺纖維化（IPF）的臨床治療［9］。最近，一項基于轉錄組學的研究表明，在IPF患者中，PFD改變的基因不僅在“細胞外基質”中富集，并且在“免疫反應”中也發現大量富集，在體外PFD可通過調節癌癥相關成纖維細胞（CAF）細胞因子釋放來降低其免疫抑制能力［10］。此外，小鼠的肺癌模型中PFD可增加T細胞和NK細胞在腫瘤組織中的浸潤并抑制腫瘤生長［11］。這提示PFD可通過調控免疫微環境抑制腫瘤的進展［12］，但在膀胱癌中的作用未見相關報道。

有研究發現，PFD可增強PD-1/PD-L1對腫瘤的免疫治療療效，減緩了小鼠肺癌腫瘤增長提高了生存率［10］。PD-L1在抑制T細胞介導的免疫反應中起重要作用［13］。PD-L1與PD-1的結合導致效應T細胞的衰竭和腫瘤細胞的免疫逃逸，導致預后不良。已有研究結果證明，PD-L1 陽性膀胱腫瘤對PD-1/PD-L1 抑制劑（ICIs）的反應優于陰性腫瘤［14］，如何將抗PD-L1的作用不局限在部分病例當中也是本研究的重點。這些對ICIs反應不佳的腫瘤大多T細胞被限制在富含成纖維細胞的腫瘤周圍區域［15］。

本研究以C57BL/6小鼠研究對象，觀察吡非尼酮聯合PD-L1抑制劑對小鼠膀胱腫瘤的抑制作用，探討吡非尼酮通過影響腫瘤微環境來增強PD-L1抗膀胱腫瘤效應的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

小鼠膀胱癌細胞（MB49）、1640培養基、胰酶及胎牛血清（武漢普洛賽生物科技有限公司），吡非尼酮購于APExBIO公司，PD-L1 抑制劑（克 隆10 F.9G2，BioXcell），辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG、鼠抗CD3單克隆抗體、鼠抗CD8單克隆抗體、鼠抗CD8單克隆抗體（武漢三鷹公司），根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、兔抗Ly-6G單克隆抗體、兔抗CD11b多克隆抗體購自Abclonal；Matrigel基質膠（康寧）；工作臺、CO2培養箱、多功能酶標儀、冷凍離心機（Thermo）。

1.2 實驗動物

選取C57BL/6雌性小鼠40只（江蘇省協同醫藥生物工程責任有限公司），體健，6周齡，體質量18 g，飼養室溫20～24 ℃，自由飲食，12 h晝夜交替。本實驗遵循國家實驗動物管理保護條例，并通過蚌埠醫學院倫理委員會批準（倫動科批字[2017]第021號）。

1.3 小鼠異位腫瘤模型的建立

于接種前1 d備皮，用0.1 mL的PBS及稀釋后的基質膠2∶1混勻重懸2×106個MB49細胞，于20 ℃的環境中向抓取固定的小鼠右側腋下進行皮下注射腫瘤細胞。于腫瘤達200 mm3時開始干預給藥，腫瘤體積（TV）計算為腫瘤最長直徑（D）和短直徑（d'，d''）的乘積：TV=D×d'×d''［16］。

1.4 小鼠分組及處理

將40只荷瘤鼠隨機分為對照組（建立腫瘤模型正常飲食）、PD-L1 抑制劑組（腹腔注射PD-L1 抑制劑，12.5 mg/kg，1次/3 d，）、PFD組（PFD 500 mg/kg口服，1 次/d），聯合治療組（PFD及PD-L1抑制劑按上述劑量聯合應用），每組10只小鼠。建模14及21 d時，處死小鼠，手術剝離小鼠腫瘤，制作石蠟切片保存。眼眶取血留存待測。

1.5 免疫組織化學（IHC）和免疫熒光染色（IF）

脫蠟水化后將組織切片浸入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中行抗原修復。3%H2O2溶液浸泡15 min后，PBS沖洗3次，每次5 min。加入抗體4 ℃孵育過夜。加入二抗，放入濕盒，37 ℃放置20 min，PBS沖洗。DAB工作液顯色，蘇木青復染，然后進行1%鹽酸分化、脫水、透明、中性樹脂封片。光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0～3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1～4 分為0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%），最終將分數相乘，進行比較。對于免疫熒光，用DAPI染色細胞核，用奧斯巴林顯微鏡進行觀察。

1.6 生物安全性評價

對于血液生化評估，如上所述收集血液，通過Chemray 240自動生化分析儀（雷托科學，中國深圳）進行分析對比不同分組小鼠血清中丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶(AST)及肌酐（Cr）的差異。

1.7 統計學分析

采用SPSS 25.0 統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以Ρ≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PFD聯合PD-L1抑制劑抑制膀胱癌生長

在藥物干預后第21 天，聯合用藥組小鼠腫瘤體積（F=136.800，Ρ＜0.05）明顯小于單藥組及對照組，并且小鼠腫瘤抑制率（F=126.800，Ρ＜0.05）和生存率（Ρ＜0.05）也明顯高于單藥組及對照組（圖1）。

圖1 藥物干預小鼠膀胱腫瘤模型Fig.1 Effect of pirfenidone and PD-L1,alone or in combination,in the mouse models bearing bladder cancer xenografts.A:Treatment protocol diagram. B: Comparison of tumor volume at 21 days. C: Survival curves in the 4 groups.*P＜0.05 vs control.D:Tumor growth rate in each group.*P＜0.05,**P＜0.01 vs PFD+α-PD-L1 group.

2.2 聯合治療抑制了膀胱腫瘤細胞的上皮間充質轉化

通過IHC實驗對小鼠膀胱腫瘤組織進行檢測發現，單藥和聯合用藥小鼠較對照組小鼠腫瘤組織中上皮細胞標志物E-cadherin表達量（圖2A、C）增加（Ρ＜0.05），而間充質標志物N-cadherin 表達量（圖2B、D）降低（Ρ＜0.05）。尤其聯合用藥顯著減少N-cadherin。

圖2 4組小鼠腫瘤組織中E鈣粘蛋白與N鈣粘蛋白表達量比較Fig.2 Comparison of E-cadherin and N-cadherin expression in the tumor tissues among the 4 groups.A:Immunohistochemistry(IHC)for E-cadherin(Original magnification: ×200).B:IHC for N-cadherin(×200).C,D:Quantitative analysis of IHC staining results of E-cadherin and N-cadherin.*P＜0.05,**P＜0.01 vs PFD+α-PD-L1 group.

2.3 PFD聯合PD-L1抑制劑增強免疫微環境T細胞浸潤

聯合治療后CD3+T 細胞分布發生了明顯變化（圖3A、D），更多CD3+T細胞聚集在腫瘤中心（Ρ＜0.05），而不僅限于腫瘤基質。并且腫瘤組織中CD8+T細胞（圖3B、E）及CD45+T 細胞（圖3C、F）浸潤明顯增加（Ρ＜0.05）。

2.4 PFD聯合PD-L1抑制劑減少了腫瘤微環境MDSCs表達

行IF對腫瘤組織進行CD11b及Ly6G雙染。發現PFD單藥組腫瘤CD11b陽性染色與對照組無顯著差異，聯合用藥組腫瘤組織中相比對照組及單藥組CD11b+和Ly6G+染色均明顯減少（圖4，Ρ＜0.05）。

圖4 4組小鼠腫瘤組織中MDSCs的表達量Fig.4 Expression of MDSCs in the tumor tissues in the 4 groups. A: Immunofluorescence staining of MDSCs (×200). B, C:Quantitative analysis of immunofluorescence staining results of CD11b+and Ly6G+cells.*P＜0.05,**P＜0.01 vs PFD+α-PD-L1 group.

2.5 聯合治療在體內是安全性

小鼠血清中丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、及肌酐（CRE）及乳酸脫氫酶（LDH-L）的水平均在正常范圍內（圖5，Ρ＞0.05）。

圖5 4組小鼠體質量變化及血清生化結果Fig.5 Changes in body weight and blood biochemical parameters of the mice in the 4 groups.A:Changes in body weight of the mice.B-F:Quantitative analysis ofALT,AST,BUN,CRE and LDH-Llevels.

3 討論

在臨床試驗和實際經驗中，PFD是一種耐受性良好的口服藥物，在IPF 患者中觀察到PFD 治療下肺癌發病率降低［17］，這證明PFD除了具有抗纖維化特性外，還可能對肺癌具有預防或治療的功能。在本研究中，我們同樣發現在膀胱腫瘤的小鼠身上，PFD也具有一定的抗腫瘤作用，既表現在抑制腫瘤的增長速率，也表現在增加了小鼠的生存率。事實上，多項體外研究報告了PFD干預后癌細胞的增殖和遷移減少［18,19］。并且有近期有實驗證明在小鼠腎癌中PFD通過抑制腫瘤細胞EMT從而阻止了細胞增殖，遷移和侵襲，并且通過限制腫瘤組織中MDSC募集來調節免疫環境［19］。有實驗表明，在接種腫瘤異種移植物的免疫功能低下的小鼠中，單藥PFD抗腫瘤作用在很大程度上是有限的［10］。然而，使用免疫功能低下動物的早期研究可能并不全面，因為PFD的免疫調節作用可能被忽略。而我們的實驗結果也確實驗證了這一點，即使單藥使用PFD時，其對小鼠腫瘤生長速率的影響有限，但在免疫組化的結果中，我們發現其對免疫細胞在腫瘤中心的聚集作用明顯。這也提示本實驗后續應將研究的方向聚焦于免疫微環境中。

為深入了解PD-L1抑制劑的單藥使用的局限性，有研究發現在接受PD-L1抑制劑治療的黑色素瘤患者中，有40%～65%出現了原發性耐藥［20］，而剩下的患者中也有43%在3年后獲得性耐藥［21］。本實驗同樣觀察到在單獨使用PD-L1抑制劑時，不論是對小鼠腫瘤的抑制作用，還是在免疫細胞聚集的作用都想到有限。在了解了ICIs的起效需要免疫周期的每一步都必須啟動并完成。首先是癌癥抗原呈遞和T細胞活化，然后是T細胞向腫瘤的運輸和浸潤，最后是T細胞的識別來消除腫瘤細胞［22,23］。所以，原發性和獲得性耐藥的關鍵原因是：（1）抗原呈遞和識別不足［24］；（2）腫瘤微環境中T細胞缺失［25］；（3）上調免疫抑制標志物［26］；（4）T 細胞活化不足［27］；（5）對IFN-γ信號的敏感性降低［28］。本實驗發現了聯合用藥對腫瘤微環境中T細胞的聚集作用及活化作用。并且有研究表明，PD-L1抑制劑治療依賴于CTL的浸潤和治療性抗體在腫瘤部位的積累［29,30］。然而，腫瘤微環境中由免疫抑制細胞（例如腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、調節性T細胞（Treg）和髓源性抑制細胞（MDSC）引起的免疫抑制限制了CTL的活化和增殖［31］。這也符合本實驗中聯合用藥相比單藥使用對小鼠MDSC的影響作用。而PFD聯合PD-L1抑制劑是否可以促進腫瘤抗原的提呈及其對免疫微環境的影響的具體機制仍需要進一步實驗驗證。

本研究存在一些局限性。首先，相比使用PFD和PD-L1抑制劑單藥治療，聯合治療沒有在腫瘤發展的后期達到更加明顯的抑制作用，因此，PFD 對免疫活化的確切分子作用方式仍有待進一步探討。盡管在實驗中PFD 服用的頻率很高，但通過對血液的生化分析，我們并未發現藥物的干預對各組小鼠的肝腎功能帶來明顯損傷。所以后期實驗可考慮在腫瘤生長不同階段增加藥物劑量進行治療，以探究PFD聯合PD-L1抑制劑治療對腫瘤的抑制作用及對CTL的影響是否呈濃度依賴性。并收集各時段中腫瘤組織，動態觀察各類腫瘤微環境中免疫抑制細胞及各種趨化因子的分布及數量。

綜上所述，本研究確定了PFD的一項新作用，即通過促進膀胱腫瘤中T細胞的浸潤并減少腫瘤細胞EMT及MDSC的浸潤調節腫瘤免疫微環境，增強PD-L1抑制劑的抗腫瘤作用。我們的發現初步揭示了PFD的免疫調節作用，為臨床上治療膀胱腫瘤化療藥物的應用提供了新的思路。