Rho激酶抑制劑Y27632促進人誘導多能干細胞來源原始神經上皮細胞向多巴胺能神經前體細胞的轉化

李洋洋，徐佳佳，姜誠誠，陳子龍，陳 穎，應夢嬌，王 澳，馬彩云，王春景，郭 俁，劉長青

蚌埠醫科大學1安徽省神經再生技術與醫用新材料工程研究中心，2生命科學學院，安徽 蚌埠233000

帕金森?。≒D）是一種進行性神經退行性疾病，是60歲以上人群中第2常見的神經退行性疾病，其主要原因是黑質致密部（SNc）多巴胺能（DA）神經元的死亡和含α-突觸核蛋白的路易體的形成［1］。目前，帕金森病的主要治療方法是藥物治療，常用藥物包括DA激動劑、單胺氧化酶B抑制劑和左旋多巴等［2-4］。然而，藥物治療只能改善患者的癥狀，不能從根本上治愈帕金森疾?。?,6］。使用細胞移植替代損失的DA神經元以恢復神經傳遞，逐漸成為治療PD 的重要手段［7-9］。

近年來，人誘導多能干細胞（hiPSC）誘導的DA神經元移植入嚙齒動物和靈長類動物PD模型中，能夠安全有效地改善PD模型動物的運動功能［10-13］。日本科學家將同種異體人iPSCs衍生的DA能神經元前體移植到PD患者殼核中開創臨床試驗［14］。將帕金森病患者來源的iPSCs誘導為中腦多巴胺能祖細胞，植入帕金森病患者的殼核，術后18～24個月帕金森病癥狀穩定并得到改善［15］。然而，人iPSC-NECs向iPSC-DA神經前體細胞轉化過程中細胞的存活率不高，嚴重限制了iPSC-DA神經前體的臨床應用。

IPS細胞體外培養脫離過程中容易發生凋亡現象，尤其人iPSC-NECs膠原酶消化重新接種向DA神經元誘導過程中［16-18］，其原因可能是Rho/ROCK信號通路介導細胞骨架蛋白磷酸化，打破了肌動蛋白-肌球蛋白收縮力和E-鈣粘蛋白依賴性細胞-細胞粘附之間的平衡，促進肌動蛋白-肌球蛋白收縮而導致細胞死亡。ROCK途徑的活化［17］。而抑制ROCK 信號通路的小分子Y-27632可增加人胚胎干細胞的存活和生長，被廣泛用于干細胞研究［19-21］。

此外，ROCK抑制劑Y27632可促進神經元分化和神經突生長，并減少多種干細胞類型中的神經突收縮［22-24］。ROCK抑制劑通過細胞外信號調節激酶途徑強烈促進胚胎干細胞分化為神經元，并且在動物模型中抑制移植后細胞的急性凋亡［22,25］。

目前將人iPSCs進行神經分化的主要方案是“雙SMAD”抑制方案，該誘導的過程中細胞死亡較多，尤其是在誘導第一階段結束，細胞解離重新接種時細胞存活率低。因此本研究對人iPS細胞誘導DA神經前體細胞方法進行優化［26］，在第一階段將人iPSCs誘導至原始神經上皮細胞，細胞消化重新接種時嘗試加入Y27632，顯著提高了細胞的存活率，24 h及時去除Y27632后，未影響后續向DA神經元前體分化，提高了人iPSCs-DAPs定向分化的效率。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人新生兒包皮細胞來源的人誘導型多能干細胞（hiPS細胞）購于中國科學院典型培養物保藏委員會干細胞庫（目錄號SCSP-1301）。

1.2 主要試劑

HiPSCs 培養基 mTeSRTMBasal Medium（STEMCELL）、DMH1（Tocris Bioscience），Poly-lornithine hydrobromide、Laminin、6-羥基多巴胺、阿撲嗎啡（Sigma），SB431542（StemGent），Purmorphamine（Millipore），SHH（Sino Biological）、FGF8（R&D systems）、CHIR99021（Selleckchem），Y-27632、cAMP、BDNF、GDNF（PeproTech）、維生素C（BioShap）、DAPI染料、中性紅染液、BCIP/NBT堿性磷酸酶（AP）顯色試劑盒、CCK8 細胞增殖檢測試劑盒、BeyoClick?EdU-647細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），Neurobasal 培養基、DMEM/F12培養基、B27（Without VitaminA）、N2、NEAA、GlutaMax、Tryple Express Enzyme、Laminin、膠原酶IV（Gibco），鼠抗Sox2、鼠抗Oct4（Santa Cruz），鼠抗Nestin、鼠抗Tuj1、兔抗Pax6、兔抗TH、兔抗FOXA2、兔抗LMX1A（Abcam），兔抗NURR1、兔抗SSEA-1（Bioss），兔抗Nanog（CST），驢抗兔Cy3、驢抗鼠Cy3（Jackson Lab），驢抗兔Alexa Fluor 488，驢抗鼠Alexa Fluor 488、抗熒光淬滅封片劑、CellTracker ?CM-DiI Dye（Invitrogen）。

1.3 人iPSCs的體外培養

將人誘導多能干細胞系（hiPSCs）接種于基質膠（Matrigel）包被1 h 的T25 培養瓶里，使用mTeSRTMBasal Medium 培養基，并加入終濃度為10 μmol/L 的Y27632。次日棄除培養基，更換mTeSRTMBasal Medium培養基培養（不加Y27632），2～3 d更換培養液，每4 d傳代1次維持其未分化狀態。

1.4 人iPSCs的表型鑒定

將狀態良好的人iPSCs接種到基質膠包被的無菌細胞爬片（Coverslips）上，采用免疫熒光技術、RT-PCR和Western blotting對人iPSCs的多能性標記分子OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1的表達進行特異性檢測。

1.5 Y27632對人iPSCs向DAPs誘導分化的影響

1.5.1 人iPSCs誘導為原始神經上皮細胞（NECs）在人iPSCs克隆的生長過程中，當生長到約30%左右時，在基礎培養基mTeSRTM中添加DMH1（10 μmol/L）、SB431542（10 μmol/L）、SHH（200 ng/mL）、FGF8（100 ng/mL）和Purmorphamine（2 μmol/L），繼續培養至第3天。然后添加CHIR99021（3 μmol/L）繼續培養至第5天，更換為神經誘導培養基NIM（DMEM/F12添加N2、DMH1、SHH、CHIR99021），繼續培養至第7天。在第11 天時去除SHH 和Purmorphamine，繼續培養。隨后將細胞轉移到神經分化培養基（NEM）中，其中Neurobasal培養基中添加1%N2、2%B27-A、BDNF（10 ng/mL）、GDNF（10 ng/mL）、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax和CHIR99021。繼續培養至第13天。通過免疫熒光技術進行評估誘導細胞的表面特異性抗原PAX6、Nestin和SOX2的表達。

1.5.2 Y27632對人iPSCs-NECs向DAPs誘導的影響及檢測 吸去hiPSCs-NECs舊培養基，PBS洗3次后，加入預熱的IV型膠原酶進行消化，將細胞收集于15 mL離心管中，輕微吹散細胞后接種于PLO和Laminin包被的培養板上貼壁培養。培養基更換為Neurobasal medium，添加N2、2%B27-A、BDNF（10 ng/mL）、GDNF（10 ng/mL）、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax，并在培養基中加入不同濃度的Y27632（0、3、5、8、10 μmol/L）。24 h后更換不含Y27632的培養基，培養至第28天，每2 d半量換液，可獲得DAPs，使用免疫熒光技術檢測表面特異性抗原TH、Tuj1、FOXA2 與NURR1的表達。

1.6 CCK-法8檢測不同濃度Y27632對解離后人iPSCs-NECs的活性影響

將誘導至13 d的人iPSCs-NECs以35×104～5×104細胞/孔的密度接種在已用PLO和Laminin包被過的96孔板上，使用不同濃度的Y27632（0、3、5、8、10 μmol/L）處理并于次日更換培養基（不含Y27632）。2 d后，吸掉舊培養基，PBS清洗3次，每孔加入100 μL細胞培養基，再將10 μLCCK-8溶液加入每個孔中孵育2 h。使用酶標儀（Multiskan Sky,Thermo Fisher Scientific）在450 nm波長下測量每孔的A值，統計數據計算細胞活力，以空白組為調零孔，各組細胞活力（%）=[加藥組A450－調零組A450]/[空白對照組A450－調零組A450]×100%。

1.7 檢測Y27632對人iPSCs-NECs的細胞增殖和細胞凋亡影響

1.7.1 EdU染色檢測Y27632對人iPSCs-NECs的細胞增殖影響 將人iPSCs-NECs接種到24孔板中，使用不同濃度的Y27632（0、3、5、8、10 μmol/L）處理并于次日更換培養基（不含Y27632）。加入37 ℃預熱終濃度為10 μmol/L的EdU，繼續孵育2 h，使用4%的多聚甲醛進行固定，用洗滌液洗滌細胞3次，0.3%Triton X-100的PBS室溫孵育10～15 min。使用Hoechst 33342進行細胞核染色，室溫避光孵育10 min后在雙光子激光共聚焦顯微鏡Olympus（FV-1200MPE SHARE）下觀察細胞標記結果。

1.7.2 DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）直接染色法檢測Y27632 對人iPSCs-NECs 的細胞凋亡影響 將人iPSCs-NECs 接種到24 孔板中，使用不同濃度的Y27632（0、3、5、8、10 μmol/L）處理并于次日更換培養基去除Y27632。細胞生長2 d后，去除培養基，用PBS洗滌細胞3 次，0.3%Triton X-100 的PBS 室溫孵育10～15 min。使用DAPI 進行細胞核染色，室溫避光孵育15 min后在雙光子激光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡小體的數量。

1.8 免疫熒光技術檢測人iPSCs、NECs和DAPs細胞表面特異性抗原

將接種在coverslips 上的細胞先用4%多聚甲醛室溫固定細胞18 min，然后用0.2%Triton X-100通透8 min。接下來，在2%牛血清白蛋白（BSA）和10%驢血清中繼續封閉細胞1 h。之后，將含有特定抗體的溶液與樣本一起置于4 ℃孵育過夜。使用的抗體包括：鼠抗OCT4，鼠抗SOX2，兔抗Nanog，兔抗SSEA1，鼠抗SOX2，兔抗PAX6，兔抗Nestin，兔抗TH，鼠抗NURR1，兔抗FOXA2和鼠抗Tuj1。次日，去除一抗后，用PBS洗滌細胞3次，然后在室溫下與二抗Alexa Fluor 488或Cy3避光孵育1 h。最后，用DAPI染色細胞核，添加抗熒光淬滅劑，并使用雙光子激光共聚焦顯微鏡觀察熒光結果。

1.9 統計學分析

采用Graphpad 8.01軟件進行統計學分析并生成圖表，所得實驗數據用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以Ρ＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人iPSCs形態特征及多能性的鑒定

人iPSCs呈明顯的細胞團生長，克隆為扁平的島狀，邊緣清晰且中央細胞變得更加緊密和密集，細胞核大漿小，高表達多能性標記物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1（圖1A、B），內源性堿性磷酸酶活性染色呈陽性（圖1C）。RT-PCR 和蛋白質印跡也證實hiPSCs 可表達多種未分化的ES 細胞的特異性標記基因OCT4、SOX2、Nanog與Klf4（圖1D）。

圖1 人iPSCs的生物學特征鑒定Fig.1 Biological characterization of hiPSC.A,B:hiPSCs express pluripotency markers OCT4(green),Nanog(Red),SOX2(green)and SSEA1 (Red) (Original magnification: ×200). C: AP-positive dense cell colonies of hiPSCs (×200). D: Expression of pluripotency markers detected by RT-PCR and Western blotting.

2.2 人iPSCs-NECs誘導及特征鑒定

人iPSCs 誘導成DAPs 主要經歷兩個階段（圖2A）。第1階段，將hiPSCs誘導分化為NECs。誘導過程中，人iPSCs的集落體積逐漸增大，且邊緣細胞出現明顯分化現象，誘導至第13天時，顯微鏡下觀察細胞集落分化為典型玫瑰花結式的神經管樣結構，即為人iPSCs-NECs（圖2B）。經免疫熒光染色結果顯示，細胞誘導成為Pax6+[（96.1±1.0）%]、Nestin+[（92.5±0.8）%]與SOX2+[（97.5±1.0）%]的原始神經上皮細胞（圖2C、D）。

圖2 人iPSCs誘導DA神經元前體細胞的時間軸以及人iPSCs-NECs標記物檢測Fig.2 Induced differentiation of hiPSCs into hiPSCs-DA progenitors.A:Timeline of induced differentiation procedure,including NECs induction and DAPs induction stages.B:Morphological changes of DAPs derived from hiPSCs at the two stages during differentiation(×100). C,D:NECs derived from hiPSCs express neuroepithelial markers SOX2（green）,Nestin(red)and Pax6(Red)(×200).

2.3 Y27632 促進人iPSCs-NECs 向DAPs 定向分化的研究

相比于未加Y27632的對照組，添加Y27632后可明顯提高hiPSCs-NECs貼壁與存活，當Y27632濃度為5 μmol/L 時，細胞存活率顯著提高（Ρ＜0.01，圖3A）。CCK8 檢測結果表明，Y27632 的濃度為3 μmol/L 時，細胞活力較對照組的提高3.4倍，當Y27632的濃度為5 μmol/L時，細胞活力較對照組提高6.2倍（Ρ＜0.01，圖3B），當Y27632的濃度為8 μmol/L、10 μmol/L與5 μmol/L時無明顯差異。根據這些結果，選擇濃度為5μmol/L的Y-27632用于后續的體外細胞誘導分化實驗。

圖3 Y27632對人iPSC-NECs消化后重新接種存活的影響Fig.3 Survival of hiPSCs-NECs treated with different concentrations of Y27632.A:Survival of hiPSCs-NECs treated with 0,3,5,8,and 10 μmol/LY27632 for 24 h(×100).B:Viability of the treated hiPSCs-NECs assessed using CCK8 kit.**P＜0.01.

2.4 檢測Y27632對人iPSCs-NECs增殖能力和細胞凋亡的影響

將hiPSCs-NECs 膠原酶IV 消化后，重新接種到PLO和Laminin包被24孔培養板中，神經分化培養基中加入不同濃度的Y27632（0、3、5、8、10 μmol/L），24 h后，EdU染色結果顯示，Y27632可明顯提高處于S期的細胞數量，當培養基中Y27632的濃度為5、8、10 μmol/L時，相比較0 和3 μmol/L 組，增殖細胞比例顯著增加（Ρ＜0.01，圖4A、C）。DAPI染色結果顯示，Y27632可降低hiPSCs-NECs消化重新接種后細胞凋亡率，而且當Y27632的濃度高宇5 μmol/L時，相比較低濃度組，凋亡細胞比例顯著降低（Ρ＜0.05，圖4B、D）。

2.5 人iPSCs-DAPs的誘導及特征鑒定

將hiPSCs-NECs在神經分化培養基繼續培養，誘導至第24～28天時，細胞逐漸形成菊花樣結構，可見明顯的軸突和樹突（圖5A）。免疫熒光檢測結果顯示，誘導細胞高表達DAPs標記物TH（97.3±1.2）%、FOXA2（97.8±1.5）%、NURR1（94.2±1.0）%和Tuj1（84.1±1.5）%（圖5B、C）。

圖5 人iPSCs-DAPs的表面特征標記物的表達Fig.5 Characteristics of hiPSCs-DAPs at stage 2.A:After treatment with different concentrations of Y27632(0,3,5,8 and 10 μmol/L),the morphological changes of hiPSCs-NECs were observed after further induction for 28 days. B, C: Immunofluorescence results show that hiPSCs-DAPs express the specific markers of midbrain dopamine neurons Nurr1(green),TH(Red),Tuj1(green)and FOXA2(Red)(×200).

3 討論

多巴胺能神經元體外誘導多采用胚胎干細胞或胚狀體神經球，但是胚胎干細胞的治療面臨著長期臨床應用的免疫學和倫理學挑戰，神經球因細胞位置不同，不能保障誘導細胞的同質性［27］。人iPS細胞為體外高效DA神經元奠定了基礎，解決了免疫排斥的風險和臨床應用的倫理問題［28］。本項目組前期建立一種了基于2D培養系統的高效誘導DAPs的單層細胞培養體系，通過Purmorphamine 激活Sonic Hedgehog（SHH）信號通路和CHIR99021（GSK3 抑制劑）激活WNT通路促進中腦細胞分化，并通過雙重SMAD抑制（暴露于DMH1和SB431542）增強iPSCs向中腦DAPs的分化，確保產生FOXA2/LMX1A1表達的DAPs細胞［26］。然而，基于2D的單層體系亦存在hiPSCs-NECs解離過程中容易發生細胞凋亡，造成大量的細胞損失現象［29］。

Rho激酶（ROCK）小分子抑制劑Y-27632可以增加細胞之間的相互作用，并影響細胞與細胞外基質（ECM）微環境的調節，從而通過與微環境的相互通信，主動或被動地影響細胞的命運，如增殖、遷移、分化和凋亡等［30-33］。Y-27632是阻斷ROCK通路Rho（GTP酶的主要下游效應物）活性的生物活性分子，調節多種細胞功能，如促進人胚胎干細胞的存活和生長，被廣泛用于干細胞研究［19］。而且Y27632可提高干細胞分化與誘導效率，顯著增加細胞存活和集落形成，并抑制解離后誘導細胞的死亡，并且不影響人iPSCs的多能性及其體外分化［33］。

本研究中人iPSCs衍生的DAPs的分化過程遵循兩個主要階段。首先，人iPSCs被誘導至第1階段結束時，其特征類似于原始神經上皮（NECs），可表達SOX2、NECtin和Pax6 特異性標志物。第1階段結束后，第2階段是神經分化培養基中的神經譜系特異性誘導，為提高hiPSCs-NECs解離過程中存活，抑制細胞凋亡，在此階段的前1 d加入不同濃度的Y27632，結果表明原始神經上皮細胞消化后，ROCK抑制劑Y27632可顯著增加細胞粘附和增殖，提升hiPSCs-NECs 細胞存活率，抑制細胞凋亡過程［34］。而且，CCK8細胞活力檢測表明當Y27632的濃度達到5 μmol/L時，與濃度為8 μmol/L、10 μmol/L無明顯差異。同時，EdU染色的結果也證明，當Y27632的濃度達到5 μmol/L時，細胞的增殖能力明顯提高。

然而，iPSCs體外分化過程中，Rho激酶抑制劑濃度超過10 μmol/L，可能導致其分化為所有3個胚層（即外胚層、中胚層和內胚層），極大地損害了人iPSCs定向誘導分化的能力［35］。因此，在促進細胞貼壁存活后應及時去除Y27632，以免對后續的分化產生未知的影響。本研究使用5 μmol/L濃度的Y27632促進hiPSCs-NECs解離重新接種24 h 后，更換新培養基，及時去除Y27632，持續誘導細胞至28 d后，可獲得多巴胺能神經元前體細胞（DAPs），高表達DAPs標記物TH、FOXA2、NURR1和Tuj1。因此加入濃度為5 μmol/L的Y27632，未對后續iPSCs-DAPs誘導產生明顯的影響。

綜上所述，本研究在人iPSCs定向誘導DAPs細胞過程中，在第1階段人iPSC-NECs解離重新接種時加入5 μmol/L的Y27632，可顯著提高iPSCs-NECs解離后的貼壁、存活和增殖，并且可減少凋亡細胞的比例，從而增加了后續分化過程中的細胞數量，間接的提高了分化效率。24 h 后去除Y27632，未對后續體外定向誘導iPSCs-DAPs的分化潛能產生影響。因此，在培養系統中補充ROCK 抑制劑Y27632提供了一種簡單、高效的方法，可用于獲得大量高純度人iPSCs衍生的多巴胺能神經前體細胞，這將為帕金森病的細胞移植治療提供重要的細胞來源。