白藜蘆醇對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經元的保護作用：基于抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路

桂建軍，孫曉東，溫 舒，劉 欣，覃冰清，3，桑 明

1湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000；2湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院轉化醫學中心，湖北襄陽 441000；3湖北省帕金森病臨床醫學研究中心，湖北 襄陽 441000；4武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰442000

帕金森?。≒D）主要病理表現為多巴胺能神經元的損失和背外側紋狀體多巴胺（DA）水平的下降等［1］。目前該疾病的標準療法是DA替代療法，但這種療法治標不治本，且存在著較大的副作用［2］。因此，探索新的治療方案迫在眉睫?！澳c-腦”軸是將大腦和腸道功能整合的雙向信息交流系統，在PD等神經退行性疾病的研究中備受關注［3］。腸黏膜屏障（IBF）作為“腸-腦”軸的組成是阻止腸道內細菌及內毒素進入機體的第一道防線［4］。研究表明，IBF功能受損及通透性增加與PD、阿爾茨海默病、多發性硬化等中樞神經疾病有關［5］。PD患者保持較高的脂多糖（LPS）水平，LPS與LPS結合蛋白（LBP）結合并被放大效應，以CD14 和TLR4 作為受體，激活免疫細胞，導致促炎癥因子瀑布式釋放，進一步引起神經炎癥和氧化應激反應［6］。TLR4通過調節先天免疫來維持腸道微生物耐受性和炎癥之間的平衡，腸上皮TLR4表達增加與IBF受損和上皮細胞分化改變相關［7］。白藜蘆醇（RES）是一種廣泛存在于植物中的天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、神經保護等多種生物活性［8］。研究表明，RES通過抑制TLR4信號通路活性減輕炎癥反應［9］。但RES是否通過抑制TLR4表達修復IBF，進而抑制神經炎癥的發生，減少DA能神經元的損失，目前尚未見報道。

本研究以MPTP誘導的PD模型小鼠為研究對象，評估RES對該模型小鼠的保護效果，探究RES通過抑制TLR4介導的“腸-腦”軸炎癥信號分子的級聯反應，保護PD小鼠DA能神經元的作用機制，為PD的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10周齡雄性C57BL/6J小鼠52只，體質量30±5 g，由湖北醫藥學院動物中心提供，生產許可證號：SYXK（鄂）2019-0031，動物合格證號：SYXK（鄂）2019-0008。實驗動物飼養于SPF級動物飼養室，每籠5只，自由飲水及進食，室溫20～26 ℃，每日交替12 h的光明與黑暗周期。飼養過程中嚴格按照《實驗動物管理條例》，使用的3R原則給予人道的關懷，確保實驗動物的福利倫理，該動物實驗通過湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院生物醫學基礎研究倫理委員會審批(審批號：XYYYE20230035)。

1.2 主要試劑及儀器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP,MedChemExpress）；白藜蘆醇（Sigma-Aldrich）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒[碧云天生物科技有限公司（杭州）]、Pierce?BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo Scientific?），TLR4 多克隆抗體，MyD88 多克隆抗體，NF-κB p65多克隆抗體，ZO-1 多克隆抗體，Claudin-1，TH 多克隆抗體，Synuclein-α 多克隆抗體[武漢三鷹生物技術有限公司（武漢）]，Synuclein-α（phospho Ser129）多克隆抗體（ImmunoWay），NF-κB p65 多克隆抗體（Cell Signaling Technology），HRP標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔的二抗（Jackson ImmunoResearch）；0.22 μm PVDF 膜（MILLEX GP）；蛋白/核酸凝膠成像儀（Bio-Rad）。LPS檢測試劑盒和LBP檢測試劑盒（廈門侖昌碩生物公司）。

1.3 實驗分組及模型的構建

小鼠適應性喂養1周，按照隨機數字表法分為對照組（n=12）、MPTP組（n=14）、MPTP+RES30組（n=13）和MPTP+RES90組（n=13）。模型組連續腹腔注射MPTP（30 mg/kg）7 d［10-11］，對照組相應的腹腔注射等劑量PBS。治療組在造模的第2天分別給予低劑量（30 mg/kg）和高劑量（90 mg/kg）RES灌胃治療，每2 d灌胃1次，連續灌胃3周。每周稱體質量1次，以便根據體質量調整灌胃量［12］。末次給藥后，小鼠禁食不禁水，異氟烷氣體麻醉，經心臟采血于抗凝管，500×g離心10 min后，分離血漿，分裝后置于-20 ℃冰箱保存備用；取下完整腦組織，沿矢狀縫將其分為左右兩部分，一半液氮速凍后，轉移至-80 ℃冰箱，用于提取組織RNA或蛋白，另一半置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，對黒質區和紋狀體區后進行免疫熒光檢測，每個蠟塊的切片深度保持一致；取臨近回盲部（＜4 cm）的近端結腸組織，部分液氮速凍后，轉移至-80 ℃冰箱，用于提取組織RNA或蛋白，部分用4%多聚甲醛固定。

1.4 小鼠運動功能檢測

在給藥前對小鼠預先進行訓練，在預先訓練及正式實驗期間，每只小鼠進行3次實驗，每次實驗間隔一定的時間，計算3次實驗結果的均值。

1.4.1 平衡木實驗 采用一根結實的平行棒（直徑1 cm，長115 cm），末端與平臺上放置的黑色小暗箱（15 cm×15 cm×15 cm）相連接，平衡棒離地高度30 cm，記錄被測小鼠經過平行棒上的時間，以及一側后肢掉下或者摔倒、搖擺等情況［13］。記錄小鼠通過平衡木的時間，評價實驗動物后肢的協調能力。

1.4.2 懸掛實驗 實驗前準備一根不銹鋼棒用于小鼠的懸掛實驗，可纏上紗布防滑，兩頭放于架子上便于固定，不銹鋼棒離地高度30 cm，被測小鼠倒置懸掛于不銹鋼棒中點后放開小鼠，觀察小鼠后肢抓繩狀況，進行評價。評分標準：兩后肢均抓不銹鋼棒記3分，一只抓棒記2分，均不抓棒記1分，實驗重復3次取平均值，每次實驗間隔10 min［14］。

1.4.3 爬桿實驗 自制一根直徑為1 cm、長50 cm的木桿，頂端固定有一直徑2.5 cm的軟木小球，木桿纏上紗布防滑并傾斜45°放置于小鼠生活的籠中，將被測小鼠頭向下放置在軟木小球的頂部，使其沿著桿自然爬下，從小鼠接觸小球開始計時，到小鼠前爪著地為止，觀察小鼠在下行過程中的行為并記錄小鼠從從木桿頂部小球爬至桿底所用時間［14］。每只小鼠要完成3次爬桿實驗，每次實驗間隔10 min，取3次爬桿耗時的平均值作為該只小鼠的實驗成績。

1.5 HE染色和尼氏染色

HE染色法觀察腦組織及結腸組織形態病理改變：將小鼠處死后，取腦組織和結腸組織，采用4%多聚甲醛固定，經石蠟包埋后進行切片，厚度為腦組織3 μm，腸組織4 μm；切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫水，撈片，65 ℃烤片過夜，HE染色。切片使用奧林巴斯顯微鏡拍照觀察。

尼氏染色觀察腦組織神經元形態及樹突棘的數量：生理鹽水進行小鼠心臟灌流，麻醉處死小鼠后分離完整腦組織，進行石蠟包埋。取腦組織切片5 μm，尼氏染液染色15 min，950 mL/L酒精分色；再次經梯度酒精脫水和二甲苯透明后，進行中性樹膠封片，完成尼氏染色。200倍顯微鏡下觀察腦組織黑質和紋狀體部位神經元形態和樹突棘的數量。

1.6 免疫組織化學

取小鼠中腦組織和結腸組織，4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋，5 μm連續切片，經乙醇梯度脫水，用EDTA（pH=9.0）抗原修復，冷卻后PBS洗滌5 min；放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，PBS洗滌（3×5 min）；在組化圈內滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min；滴加一抗P-α-Syn（S129）、TH、α-syn、TLR4，4 ℃過夜。添入二抗工作液，室溫孵育50 min；PBS洗滌（3×5 min）。DAB溶液顯色，陽性染色為棕黃色，自來水終止反應，在顯微鏡下觀察組化染色結果并進行拍片。

1.7 免疫熒光（IF）和透射電鏡（TEM）

免疫熒光檢測組織表達的蛋白：取腦組織，脫水固定后冰凍切片包埋劑包埋，使用冰凍切片機（Leica）連續切成10 μm厚的冠狀切片。切片先后經歷復溫、丙酮固定、檸檬酸鈉抗原修復、封閉、孵育一抗、孵育二抗、成像等過程，隨后進行免疫熒光染色。所用抗體分別為抗TH抗體（1∶50）、抗GFAP抗體（1∶100）、抗Iba-1抗體（1∶100）、抗TLR4抗體（1∶100）和山羊抗兔IgG熒光二抗（1∶200）（以上抗體均購于武漢三鷹生物技術有限公司）。二抗清洗后，用DAPI染核5 min，PBS清洗3次，5 min/次，滴加熒光淬滅封片液，蓋玻片封片，指甲油固定。風干后置于200倍倒置顯微鏡下觀察并拍照。

TEM觀察造模方法對小鼠結腸組織超微結構變化的影響：將固定在電鏡固定液中的結腸組織進行固定、梯度脫水、滲透、包埋、固化、切成超薄片、醋酸鈾和枸酸鉛雙染色，進行透射電鏡觀察和拍照，觀察細胞超微病理學變化，步驟如下：戊二醛前固定→漂洗→脫水→包埋→超薄切片→鈾、鉛染色→電鏡觀察。

1.8 Western blotting檢測

中腦組織20～40 mg和結腸組織50 mg，加入RIPA裂解液200～400 μL，用超聲破碎儀裂解至無明顯粘稠狀勻漿，BCA 法測定總蛋白濃度，-20 ℃保存。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒流轉膜90 min結束后，室溫下于5%脫脂牛奶中封閉1.5 h。1×TBST洗滌3次后，置于一抗稀釋液（TH、α-syn、ZO-1、Claudin-1、TLR4、MyD88、NF-κB）中，4 ℃過夜孵育，用TBST洗膜（4×7 min）；于相應1∶4000比例稀釋的二抗中37 ℃孵育1.5 h，TBST洗滌（4×7 min），ECL顯色，曝光、洗片，應用凝膠成像系統（Bio-Rad）對膜進行檢測，以GAPDH和β-actin為內參，利用Image J軟件進行目的條帶灰度分析，結果取目的蛋白與GAPDH 或β-actin 條帶灰度值的比值。

1.9 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

小鼠麻醉后經心臟采血于抗凝管，500×g離心10 min分離血漿，小份分裝保存于-20 ℃，測定前復融，混勻。收集糞便后，-80 ℃保存，測定前復融，用PBS（1∶9）稀釋混勻，500×g離心10 min 后取上清。按照ELISA測定試劑盒說明書測定小鼠血漿和糞便中LPS、LBP的含量。

1.10 統計學分析

數據分析采用GraphPad Prism 9.0 軟件完成，計量數據采用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多重比較采用方差分析及q檢驗，Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RES改善PD小鼠的運動功能障礙

平衡木實驗結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠通過平衡木的總時長增加；與MPTP組相比，RES不同劑量治療組小鼠通過平衡木的總時長縮短（Ρ＜0.01，圖1B）。懸掛實驗結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠評分降低（Ρ＜0.01）；與MPTP組相比，RES治療組小鼠評分升高，但差異沒有統計學意義（圖1C）。爬桿實驗結果顯示，與Control組相比，MPTP組小鼠爬桿總時長增加（Ρ＜0.001）；與MPTP組相比，RES不同劑量治療組小鼠爬桿總時長縮短（Ρ＜0.01，圖1D）。

圖1 RES改善PD小鼠的運動功能障礙Fig.1 Resveratrol(RES)improves dyskinesia in PD mice.A:Timeline of the animal experiment.B:Cross beam test.C:Hang test.D:Pole test.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 RES改善PD小鼠DA能神經元損傷

尼氏染色觀察腦組織黑質和紋狀體區神經元狀態及數量變化，結果顯示：Control組切片整體著色較深，黑質區神經元多且排列緊密，細胞輪廓清晰；MPTP組切片整體著色較淺，黑質區神經元數量明顯減少，排列松散，且細胞輪廓模糊；MPTP+RES30組切片整體著色較深，黑質區神經元排列較致密、細胞輪廓清晰；MPTP+RES90組整體著色較深，黑質區神經元排列整齊、清晰（圖2A）；紋狀體區尼氏染色結果在各組間的差異不明顯（圖2A）。免疫組織化學染色觀察黑質和紋狀體區α-突觸核蛋白（α-syn）的表達量，結果顯示：在黑質區，與Control組相比，MPTP組有明顯的棕色陽染；當給予不同劑量RES治療后，陽性染色減少。在紋狀體區，各組陽性染色比例差異不明顯（圖2B）。Western blotting檢測結果顯示，與Control組相比，MPTP組的TH表達降低（Ρ＜0.05），α-syn的表達有所升高。與MPTP組對比，MPTP+RES30組的TH表達升高，α-syn的表達降低，MPTP+RES90組TH的表達升高（Ρ＜0.05），而α-syn的表達降低（Ρ＜0.05）；與Control組相比，RES不同劑量治療組TH、α-syn的表達差異無統計學意義（圖2C～E）。

圖2 RES改善PD小鼠DA能神經元損傷Fig.2 RES improves dopaminergic neuronal damage in PD mice.A:Nissl staining of the substantia nigra region of the midbrain and the striatum (scale bar: 20 μm and 200 μm). B:Immunohistochemical detection of α-syn protein in brain tissue sections(Scale bar:50 μm and 200 μm).C:Protein levels of TH and α-syn in the brain tissue detected using Western blotting.D:Quantitative analysis of relative TH protein expression levels.E:Quantitative analysis of relative α-syn protein expression levels.*P＜0.05.

2.3 RES減輕PD小鼠的神經炎癥

HE結果顯示，Control組小鼠黑質區神經元形態正常，細胞數量較多，排列整齊；與Control組相比，MPTP組神經元數量明顯減少，排列紊亂，部分神經元胞體固縮，胞質深染。與MPTP 組相比，不同濃度的RES治療組神經元數量明顯增多，細胞排列較整齊，胞質深染的細胞數量減少（圖3A）。在紋狀體區，各組細胞形態變化不明顯（圖3A）。免疫熒光檢測發現，與Control組相比，MPTP 組小鼠黑質區GFAP和Iba-1的表達明顯增加；與MPTP 組相比，不同濃度的RES治療組小鼠黑質區GFAP和Iba-1陽性細胞及其表達明顯減少（圖3B）。

圖3 RES減輕PD小鼠的神經炎癥Fig.3 RES reduces neuroinflammation in PD mice. A:HE staining of the substantia nigra in the midbrain and the striatum (scale bar:20 μm and 200 μm).B:GFAP-and Iba-1-positive neurons and DAPI(blue)immunofluorescence double staining of GFAP-and Iba-1-positive neurons(green)in the substantia nigra of the mice(Scale bar:50 μm).

2.4 RES改善PD小鼠的腸道屏障功能

ELISA結果顯示，與Control組對比，MPTP組小鼠糞便中LPS、LBP水平升高（Ρ＜0.01）；與MPTP組相比，MPTP+RES30組糞便中LPS（圖4A）、LBP（圖4B）水平降低（Ρ＜0.05,Ρ＜0.01）。與Control組對比，MPTP組小鼠血清LPS、LBP水平升高（Ρ＜0.05,Ρ＜0.01）；與MPTP組相比，MPTP+RES30組LPS（圖4C）、LBP（圖4D）水平降低（Ρ＜0.001,Ρ＜0.05）。利用TEM觀察各組小鼠結腸組織的超微結構（圖4E），Control組結腸壁緊密連接復合體形態正常，腸絨毛排列整齊且緊密；MPTP組連接復合體數量減少，腸絨毛形態異常且排列紊亂；MPTP+RES30組結腸組織細胞超微結構有所改善，與Control組比較無明顯差別。Western blotting檢測結果顯示，與Control組相比，MPTP組的ZO-1、Claudin-1表達降低（Ρ＜0.01）；與MPTP組對比，MPTP+RES30組的ZO-1、Claudin-1表達升高（Ρ＜0.01，圖4F）。

圖4 RES改善PD小鼠的腸道屏障功能Fig.4 RES improves intestinal barrier function in PD mice.A-D:Fecal and plasma levels of LPS and LBP in the mice measured using ELISA.E:Transmission electron microscopy of the ultrastructure of the intestinal mucosa of the mice(Scale bar:2000 nm and 500 nm).Red arrows indicate tight junction complexes and blue arrows indicate the intestinal villi.F:Protein levels of ZO-1 and Claudin-1 in colon tissue detected using Western blotting. G:Quantitative analysis of relative ZO-1 protein expression levels.H:Quantitative analysis of relative Claudin-1 protein expression levels.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 RES 抑制PD 小鼠結腸中α-syn 的累積和TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活

免疫組化結果顯示，與Control組對比，MPTP組結腸壁和腸粘膜都有大量的棕黃色沉積；經過RES治療后，大量沉積減少（圖5A）。進一步檢測各組小鼠結腸組織蛋白的表達情況，與Control組相比，MPTP組的TLR4、MyD88、NF-κB表達升高（Ρ＜0.05、Ρ＜0.01、Ρ＜0.001）；與MPTP組對比，MPTP+RES30組TLR4、MyD88、NF-κB表達降低（Ρ＜0.05、Ρ＜0.01、Ρ＜0.001，圖5B～E）。

圖5 RES抑制PD小鼠結腸中α-syn的累積和TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活Fig.5 RES inhibits accumulation of α-syn and activation of the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in the colon of PD mice. A:Immunohistochemical detection of α-syn,p-αsyn,and TLR4 proteins in colon tissue sections(scale bar:50 μm and 200 μm).B:Protein levels of TLR4,MyD88,and NF-κB in colon tissue detected using Western blotting. C:Quantitative analysis of relative TLR4 protein expression levels. D:Quantitative analysis of relative MyD88 protein expression level.E:Quantitative analysis of relative NF-κB protein expression levels.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 RES下調腦黑質區TLR4的表達，上調TH的表達

免疫熒光檢測發現，TLR4 陽性神經元細胞呈紅色，TH陽性神經元細胞呈綠色，DAPI標記細胞核呈藍色。與Control組相比，MPTP 組小鼠中腦黑質區蛋白表達TLR4陽性神經元的數目明顯增加、TH陽性神經元的數目明顯減少（Ρ＜0.05、Ρ＜0.01）；與MPTP 組相比，MPTP+RES 組小鼠中腦黑質區TLR4陽性細胞的數目明顯減少、TH 陽性神經元的數目明顯增加（Ρ＜0.05，Ρ＜0.01，圖6）。

圖6 RES下調腦黑質區TLR4的表達，上調TH的表達Fig.6 RES downregulates the expression of TLR4 and upregulates the expression of TH in the substantia nigra of the mice. A:Immunofluorescence double-stained image of TLR4-positive neurons (red fluorescence) and TH-positive neurons (green fluorescence)in the substantia nigra of the mice.The fluorescence intensity represents the level of expression(Scale bar:100 μm).B:Expression of TLR4.C:Expression of TH.*P＜0.05,**P＜0.01.

3 討論

本研究發現RES可以顯著改善MPTP誘導的PD小鼠模型的DA能神經元丟失、神經炎癥和運動功能障礙，這和以往的相關研究結果是一致的［15］。同時，觀察到MPTP 誘導的小鼠模型結腸組織中TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路活化和顯著的腸道屏障功能下降，而RES可以顯著抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，并保護腸屏障功能。在PD模型上的廣泛研究大都證明RES可以通過抑制神經炎癥［16］、抗氧化應激［17］、保護線粒體功能［18］以及表觀遺傳修飾等［19］途徑發揮作用。最近的研究發現RES還可以通過調節腸道菌群發揮對PD模型的神經保護作用［20］。自Braak等［21］提出了帕金森病腸道起源假說以來，“微生物-腸-腦”軸在PD病理進展中的重要作用已被廣泛研究［22］。研究人員發現一種特定的益生菌-枯草芽孢桿菌能夠清除表達人α-syn的線蟲模型中的α-syn團塊，并改善運動障礙［23］。本研究發現MPTP誘導的PD小鼠黑質區α-syn表達升高，腸道中α-syn也存在異常累積；更重要的是，該模型小鼠糞便和外周血中LPS、LBP水平均顯著升高，TEM檢測和Western blotting檢測的結果進一步支持了MPTP誘導的PD小鼠模型存在腸屏障損傷。研究表明，PD前驅期患者腸道中存在α-syn的異常聚集［24-25］；PD患者外周血中LPS水平顯著升高［26］；而且，PD患者往往伴隨著便秘、胃脹氣、消化不良等胃腸問題［27］。由此可見，MPTP誘導的PD小鼠模型也在一定程度上模擬了PD相關的非運動功能障礙。

研究證明，腸道中的LPS水平升高會導致腸道通透性增加［28］，進一步引起免疫炎癥反應，從而損傷神經系統［29］。有研究發現，LPS通過與腸道屏障和血腦屏障的TLR4相互作用來激活免疫細胞［30］。本研究發現RES對模型小鼠腸道和中腦的TLR4激活現象有顯著抑制效應。TLR4作為一種跨膜受體，外在受體區域與LPS等分子結合激活跨膜區域，促使信號轉導區域激活下游途徑［31］。因此認為TLRs是介導腸道菌群改變引起的腸道炎癥與基因相關相互作用的重要橋梁［32］。而TLR4的信號轉導途徑主要包括兩種：MyD88 依賴性途徑和TRIF依賴性途徑。在MyD88依賴性途徑中，TLR4激活后，MyD88蛋白介導下游信號，引起IL-1β和TNF-α等炎癥因子的產生。在TRIF依賴性途徑中，TLR4可激活IRF3和NF-κB等轉錄因子，進而介導IFN-α/β的合成，進一步加劇炎癥反應［33］?；赥LR4/MyD88/NFκB炎癥通路，我們發現在PD小鼠結腸組織中，TLR4、MyD88 和NF-κB 的表達均顯著上調，RES 治療后TLR4、MyD88、NF-κB的表達顯著下調，同時，小鼠糞便和外周血中LPS、LBP 水平均在RES 治療后顯著降低。研究表明，LPS 不能通過血腦屏障，但通過激活TLR4后導致3,4-二羥基苯乙酸（DOPAC）和DA的代謝失衡，引起基底節和黑質神經元的損害［34］。TLR4活化刺激天然免疫細胞釋放細胞因子和趨化因子，炎癥因子的過度分泌，則會導致相關神經元損傷和炎癥反應的加劇，形成炎癥病變的惡性循環［35］。因此，我們的研究結果表明，MPTP 誘導的PD 小鼠結腸組織中TLR4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路被高水平的LPS激活，進而發生炎癥反應介導的腸屏障損傷。而RES對該模型腸道炎癥信號通路的顯著抑制提示LPS/TLR4調節的“腸-腦”軸可能是RES發揮神經保護效應的重要途徑。

研究發現RES能夠重塑PD小鼠的腸道菌群，并通過釋放短鏈脂肪酸(SCFAs)和降低LPS 的產生，抑制LPS的易位［36］。RES可以通過下調TLR4通路減輕大鼠局灶性腦缺血后的炎癥、血腦屏障破壞和腦損傷［37］。生物信息學和機器學習的應用也預測了RES與TLR4的相互作用在PD相關的鐵死亡中的顯著意義［38］。結合我們的實驗結果，推測RES可能通過抑制TLR4的活化，降低炎癥級聯反應，保護腸屏障，進而減少LPS的溢漏；也可能通過調節腸道菌群，減少LPS的釋放，保護腸屏障，避免TLR4的活化和炎癥級聯反應。但無論是哪種作用途徑，腸道屏障功能的修復是RES在MPTP誘導的PD小鼠模型中發揮神經保護作用的關鍵環節。腸道菌群、LPS產量、腸屏障功能、TLR4活化水平之中，任一個環節的平衡被打破，最終都導致炎癥級聯反應的發生，而在MPTP誘導的PD小鼠模型中，α-syn在腸道的累積量增加，可能是炎癥級聯反應的“導火索”。以往研究表明，MPTP小鼠模型和人PD臨床表現的一個顯著區別是沒有路易小體［39］，但該模型中腦黑質區DA能神經元的丟失和運動功能障礙與人的PD臨床情況相似。因此，MPTP小鼠模型可以用來測試神經元保護藥物的療效［40］。本研究在該小鼠模型中證實了RES的神經保護效應，也證實了該模型存在腸道病變，特別是腸屏障損傷、LPS釋放和TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活。但其它類型的PD動物模型中是否也存在這一病理特征，以及腸道屏障受損、α-syn累積與TLR4活化之間的因果關系仍需要進一步探究。

綜上所述，TLR4介導的炎癥反應在帕金森病發病機制中的作用被廣泛關注，本研究證實，MPTP誘導的帕金森病小鼠模型同樣存在TLR4活化的現象，并可能通過“腸-腦”軸雙向作用加劇炎癥級聯反應。而白藜蘆醇可能通過抑制LPS誘導的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活緩解炎癥反應，修復腸道屏障，并減少α-syn在腸道的累積，進而發揮保護多巴胺能神經元的效應。