去甲澤拉木醛通過抑制AKT/CREB 信號通路抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

韓齊齊，葉夢然，金齊力，2

1蚌埠醫科大學檢驗醫學院，安徽 蚌埠 233030；2蚌埠醫科大學第二附屬醫院檢驗科，安徽 蚌埠233080

肺癌是全球最常診斷的癌癥之一，也是癌癥相關死亡的主要原因，其中非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的一種亞型，占比達80%［1,2］。目前肺癌的治療方法包括手術切除、輔助靶向治療、放化療、聯合免疫治療等，還有一些新興治療方法：例如抗體藥物偶聯物和腫瘤電場療法等，但其預后仍然不容樂觀［3］，由于目前NSCLC治療方案產生的耐藥性和副作用，有效治療肺癌仍然是一個重要的臨床挑戰，積極尋找開發新的藥物和聯合治療方法非常重要。

近年來，從天然化合物中篩選出安全有效的抗腫瘤成分成為開發新的抗腫瘤藥物的趨勢，例如，紫杉醇、長春新堿和喜樹堿等已被廣泛用于預防和治療癌癥，槲皮素、木犀草素、山奈酚等天然化合物具有的抗腫瘤特性也被廣泛研究［4］。在中國，天然化合物基于中醫療法已經作為放化療、手術切除等腫瘤治療的輔助治療手段，有很大的治療前景，NSCLC標準治療后的中醫輔助治療可緩解癥狀，提高生活質量［5］，并且相較于其他放化療藥物，中藥或其衍生物有更低的毒副作用［6］，有研究表明，天然產物不僅能夠增強順鉑治療效果，而且還能減弱其化療所導致的毒副作用［7］。去甲澤拉木醛（T-96）是從天然產物雷公藤中提取的去甲木栓烷型三萜類化合物，雷公藤具有廣泛藥理作用，不僅可以在抗炎、抗病毒等方面發揮作用，還有較強的抗腫瘤作用，在肺癌［8］、結直腸癌［9］、胃癌［10］等多種惡性腫瘤中均有報道，并且相比較于雷公藤二萜類、生物堿類成分，三萜類化合物毒性更低、不良反應少，有很大的治療潛力［11］。

蛋白激酶B（AKT）的異常激活對腫瘤的生長和進展至關重要，AKT的激活啟動磷酸化級聯反應，激活下游調控細胞生長、蛋白質合成、抑制細胞凋亡的分子［12］，環腺苷酸反應元件結合蛋白（CREB）是AKT的眾多下游分子中的一個，可以調控基因的轉錄，影響多種信號的轉導，CREB在造血和實體腫瘤中高表達，主要通過磷酸化CREB殘基（Ser133）來發揮其活性，CREB的活化導致控制腫瘤發展的下游基因表達失調，引起異常的信號傳導，進而引起腫瘤細胞的無限增殖［13-15］，因此，抑制AKT以及下游分子的活化成為癌癥治療中的有效手段。

盡管有許多研究報道了去甲澤拉木醛的抗癌、抗炎藥效，但其能否對肺癌細胞的生長發揮抑制作用，以及是否可以影響AKT的活化尚不清楚。本研究主要以非小細胞肺癌A549 和H1299 細胞為研究對象，體外觀察去甲澤拉木醛對于A549和H1299細胞增殖、細胞活力、凋亡和遷移侵襲的作用，并進一步探究可能的作用機制，為非小細胞肺癌的治療或輔助治療提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞和藥物 非小細胞肺癌細胞株A549和H1299（賽庫生物）；去甲澤拉木醛粉末和SC79（MCE）。

1.1.2 試劑和儀器 RPMI 1640 培養基、胎牛血清（Gibco）；青鏈霉素雙抗（100×）、胰酶消化液（含EDTA）、CCK-8試劑、PMSF、RIPA裂解液（Biosharp）；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒（聯科生物）；二甲基亞砜（DMSO）、特超敏化學發光底物ECL、蛋白上樣緩沖液（5×SDS）、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天）；兔源性一抗Bcl-2，Bax，β-Actin，cleaved-caspase3，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、AKT 和P-AKT，CREB 和PCREB、連接HRP的二抗（CST）；三色Marker和PAGE快速凝膠配制盒（雅酶）；硝酸纖維素印跡NC 膜（GE Healthcare Life Science）。恒溫培養箱、酶標儀Spectrophometer（ThermoFisher）；顯微鏡，DMI4000B（Leica）；可調溫高速離心機（Eppendorf）；流式細胞儀Beckman CytoFLEX flow cytometer（貝克曼）；Tanon-5200成像系統（天能）；垂直凝膠電泳系統（BIO-RAD）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 A549、H1299細胞所用培養基為含有10%FBS、1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養基，置于37 ℃、5%CO2恒定培養箱中培養，在細胞處于對數生長期時進行相關實驗。

1.2.2 CCK-8檢測細胞活力 收集細胞，以1×104/孔的密度接種于96孔板中，混勻，放入培養箱，待細胞貼壁后，加入含去甲澤拉木醛濃度為0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol/L的完全培養基，繼續培養24 h和48 h，更換含10%的CCK-8溶液的完全培養基，培養箱避光孵育1 h，使用酶標儀于450 nm處檢測每孔A值，并計算細胞活力，細胞活力（%）=（A加藥-A空白）/（A對照-A空白）×100%，實驗重復3次。

1.2.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖 收集細胞，制備為1×103/mL的細胞懸液，向6孔板中加入100 μL細胞懸液，配制成含有0、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L去甲澤拉木醛的培養基，培養7～10 d，顯微鏡下觀察克隆細胞團的形成情況。棄去培養基，PBS輕洗，每孔加入4%多聚甲醛中固定30 min，再加入結晶紫溶液染色30 min，染色結束后用流水輕洗孔板，晾干后拍照并計數克隆細胞團數目，實驗重復3次。

1.2.4 細胞形態學觀察 收集細胞，按2×105/孔的細胞密度接種于6孔板中，待細胞密度達到80%左右，棄去培養基，加入含去甲澤拉木醛濃度為0、1、3、10、30 μmol/L的完全培養基繼續培養48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態、數量的變化情況，實驗重復3次。

1.2.5 劃痕愈合實驗 收集細胞接種于6孔板中培養，待細胞匯合密度達90%以上，用移液槍槍頭沿直尺在培養板底部劃十字線，用PBS沖洗表面后，顯微鏡下觀察并拍照記錄0 h的劃痕面積，之后每孔加入含有0、0.1、0.3、1 μmol/L去甲澤拉木醛的基礎培養基，放入培養箱繼續培養48 h，在顯微鏡下觀察并拍照記錄48 h的劃痕面積。用ImageJ計算劃痕面積，代入公式計算細胞遷移率，實驗重復3次。細胞遷移率=（0 h劃痕面積-48h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell 侵襲實驗 取24 孔板和Transwell 小室，在小室上層加入100 μL的基礎培養基與基質膠混合物（基質膠∶培養基=1∶10），放入培養箱中固定。收集細胞，加入基礎培養基，制成細胞懸液，將細胞密度調整至1×105/mL，取100 μL含有0、0.1、0.3、1 μmol/L去甲澤拉木醛的細胞懸液加入到小室上層，在24孔板下室中加入600 μL完全培養基，放入培養箱中培養48 h后，取出小室，用棉棒擦拭上層，放入4%多聚甲醛中固定30 min，用PBS輕洗小室，將小室置于結晶紫溶液中染色30 min，染色結束后，PBS輕洗小室并晾干，顯微鏡下拍照并計數穿過小室的細胞數目，實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞術細胞凋亡 收集細胞制成細胞懸液，調整為1×106/mL，混勻后每孔500 μL接種于6孔板中，每孔補加1.5 mL完全培養基，混勻，放入培養箱，待細胞貼壁并增殖到70%～80%，加入含去甲澤拉木醛濃度為0、1、3、10、30 μmol/L的完全培養基繼續培養48 h，收集細胞。避光加入Annexin V-FITC和PI染料，流式細胞儀上機檢測，實驗重復3次。

1.2.8 Western blotting蛋白印跡分析 藥物處理過程同凋亡檢測的藥物處理，將6孔板置于冰上，加入合適體積的裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），待充分裂解細胞刮刀收集，BCA蛋白定量之后加入蛋白上樣緩沖液，加熱變性。蛋白上樣，電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后4℃過夜孵育一抗，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，再次洗膜后顯影曝光，實驗重復3次。

1.3 統計學分析

研究結果以均數±標準差表示，兩組之間比較采用t檢驗，兩組以上比較采用方差分析，使用GraphPad Prism8.0進行分析，Ρ＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 去甲澤拉木醛抑制非小細胞肺癌細胞增殖

CCK-8檢測結果顯示，隨著藥物濃度的升高，細胞活力逐漸下降，48 h的藥物抑制細胞活力的作用更強（Ρ＜0.05，圖1A、B）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，與空白組對比，克隆細胞團數量隨劑量梯度效應而減少（Ρ＜0.05，圖1C～E）。

2.2 去甲澤拉木醛改變非小細胞肺癌細胞形態

在倒置顯微鏡下觀察，相較于對照組，不同藥物濃度1、3、10、30 μmol/L處理兩株細胞48 h后，細胞形態和數量發生顯著變化：隨著藥物濃度的逐漸升高，細胞由形態飽滿變為細長狀，由緊密排列狀變為細胞間隙增寬，貼壁細胞數目減少、飄浮細胞（死亡細胞）數目增多（圖1F）。

2.3 去甲澤拉木醛誘導非小細胞肺癌細胞凋亡

流式細胞術分析結果表明，隨著藥物濃度的增大，凋亡細胞的比例增加，且具有濃度依賴性（Ρ＜0.05，圖2A～C）。通過Western blotting檢測了相關凋亡蛋白Bcl-2、Bax和clevaed-caspase3的表達情況，結果顯示促凋亡蛋白Bax表達上調，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調，clevaed-caspase3表達上調（Ρ＜0.05，圖2D～G）。

圖2 去甲澤拉木醛誘導非小細胞肺癌細胞發生凋亡Fig.2 T-96 induces apoptosis in NSCLC cells.A-C:Apoptosis of A549 and H1299 cells treated with 1,3,10 and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.D-G: Western blotting for detecting the expressions of cleaved caspase-3,Bax,and Bcl-2 in A549 and H1299 cells treated with 1,3,10,and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the relevant proteins levels using Image J.n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.4 去甲澤拉木醛抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲

劃痕實驗的結果表明，與空白組相比，去甲澤拉木醛明顯延長了兩株肺癌細胞劃痕愈合的時間，并且呈濃度依賴（Ρ＜0.05，圖3A～C）。Transwell 實驗進一步表明，去甲澤拉木醛處理后兩株肺癌細胞的侵襲能力受到顯著抑制，并且呈劑量依賴（Ρ＜0.05，圖3D、E）。Western blotting 結果顯示，隨著藥物濃度的增高，Ecadherin的表達上調，N-cadherin、Vimentin的表達下調（Ρ＜0.05，圖4F～I）。

圖3 去甲澤拉木醛抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲并抑制EMT的發生Fig.3 T-96 inhibits migration and invasion and suppresses EMT of NSCLC cells.A-C: Changes in the scratch area of A549 and H1299 cells treated with 0.1,0.3,and 1 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the cell migration area using Image J. D, E: Transwell assay of A549 and H1299 cells treated with 0.1,0.3,and 1 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the number of cells crossing the chambers(scar bar=100 μm).F-I: Western blotting for detecting the expressions of E-cadherin,N-cadherin,and vimentin in A549 and H1299 cells treated with 1,3,10,and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h and quantitative analysis of the protein expression levels using Image J.n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

圖4 去甲澤拉木醛抑制AKT/CREB信號通路的發生Fig.4 T-96 inhibits the AKT/CREB signaling pathway in A549 and H1299 cells.The protein expressions of PAKT/T-AKT and P-CREB/T-CREB were detected using Western blotting and quantitatively analyzed in A549 cells(A,B)and H1299 cells(C,D)treated with 1,3,10,and 30 μmol/L demethylzeylasteral for 48 h.n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs 0 μmol/L.

2.5 去甲澤拉木醛抑制AKT 及其下游分子CREB 磷酸化

通過Westernblotting實驗檢測了0、1、3、10、30μmol/L藥物濃度處理A549和H1299細胞48 h后AKT及其下游分子CREB磷酸化水平的表達情況，結果顯示P-AKT（Ser473）和P-CREB（Ser133）蛋白表達均下調（Ρ＜0.05，圖4A～D）。

2.6 AKT激動劑逆轉去甲澤拉木醛誘導非小細胞肺癌凋亡的作用

在A549和H1299兩株細胞中，單獨使用去甲澤拉木醛組（T-96組）的凋亡率高于對照組（Ρ＜0.05），與上述實驗結果一致，而去甲澤拉木醛與SC79的共處理組（T-96+SC79組）凋亡率明顯低于單獨使用藥物組（T-96組）的凋亡率（Ρ＜0.05，圖5A～D）。Western blotting結果顯示單獨使用藥物組（T-96組）相比于對照組，Bcl-2表達下調，Bax、clevaed-caspase3表達上調（Ρ＜0.05），與上述實驗結果一致，共處理組相較于單獨使用藥物組（T-96組），Bcl-2 表達上調，Bax、clevaed-caspase3 表達下調（Ρ＜0.05，圖5E～H）。

圖5 SC79逆轉去甲澤拉木醛發揮的促進細胞凋亡作用Fig.5 SC79 reverses the pro-apoptotic effects of demethylzeylasteral.A, B: Western blotting for detecting PAKT/T-AKT expressions in A549 and H1299 cells treated with demethylzeylasteral and SC79.C,D:Apoptosis of A549 and H1299 cells treated with demethylzeylasteral and SC79 detected using flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining.E-H:Western blotting for detecting the expressions of cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 in A549 and H1299 cells treated with demethylzeylasteral and SC79. n=3;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs CON group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs T-96 group.

3 討論

從天然植物中分離出的生物活性物質中開發新藥是降低抗癌藥物毒性和提高其抗癌有效性的可行途徑［16］。從雷公藤中提取的去甲澤拉木醛在結直腸癌［17］、肝癌［18］、胃癌［19］等各種類型的惡性腫瘤中表現出優秀的抗腫瘤活性，但在非小細胞肺癌中的作用少有文獻報道。細胞生長和增殖的不受調控是導致腫瘤發生的重要因素，因此我們首先在研究中通過CCK-8和克隆形成實驗驗證了去甲澤拉木醛能夠抑制A549和H1299細胞的活力和增殖，并且通過流式實驗也驗證了去甲澤拉木醛對A549和H1299細胞具有誘導凋亡的作用，通過Western blotting 實驗發現去甲澤拉木醛能夠上調Bax和clevaed-caspase3表達，下調Bcl-2表達，以上結果說明去甲澤拉木醛在體外能夠對肺癌細胞的生長發揮抑制作用，初步證明了去甲澤拉木醛的在NSCLC中的抗癌作用。

癌癥轉移是癌癥死亡的主要原因，是腫瘤治療中主要挑戰之一，我們通過劃痕實驗和Transwell侵襲實驗驗證了去甲澤拉木醛在體外能夠抑制A549和H1299細胞的遷移和侵襲作用，并且具有濃度依賴性。研究表明EMT正在成為腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵決定因素，EMT是上皮細胞獲得侵入細胞外基質的能力，并轉分化成間充質細胞的動態過程［20,21］，在轉化過程中，ECadherin等上皮基因的表達或功能丟失，而定義間充質表型的基因如Vimentin，N-cadherin，纖連蛋白的表達增強［22］。所以為了進一步解釋去甲澤拉木醛抑制肺癌轉移的可能機制，我們通過Western blotting實驗檢測去甲澤拉木醛對EMT關鍵分子的表達的影響，結果顯示去甲澤拉木醛能夠上調E-cadherin 表達，下調Ncadherin和Vimentin表達，可以證明去甲澤拉木醛能夠抑制A549和H1299細胞的EMT過程，這可能是去甲澤拉木醛抑制非小細胞肺癌轉移的機制。

PI3K/AKT通路是癌癥中最常被破壞的通路，該通路的激活與實體瘤中細胞增殖、凋亡、血管生成等多種細胞過程有關，為了進一步驗證去甲澤拉木醛抑制肺癌細胞增殖和轉移是通過影響該通路實現的，我們通過Western blotting檢測了藥物作用對AKT的磷酸化水平的影響，結果顯示，隨著去甲澤拉木醛的濃度升高，AKT磷酸化水平被抑制，而總AKT的表達不受影響，說明去甲澤拉木醛抑制了AKT的活化。接著我們使用AKT激動劑SC79進行回復實驗發現，SC79部分逆轉了去甲澤拉木醛對肺癌細胞發揮的促進凋亡作用，這說明AKT的活化在誘導細胞凋亡過程中發揮了重要作用。靶向腫瘤細胞凋亡途徑是種有效的抗癌策略，但是由于健康組織對細胞凋亡也具有一定的敏感性，因此可以選擇靶向致癌途徑或靶向腫瘤抑制通路誘導凋亡等方式來間接發揮作用，例如靶向AKT信號途徑，有研究證明在NSCLC腫瘤組織樣本中的AKT陽性率明顯高于癌旁組織樣本［23］，在NSCLC 基因突變發生率最高的EGFR突變型NSCLC中，AKT的激活可能是在治療中對EGFR抑制劑產生耐藥重要原因［24］，以上均可以說明抑制AKT的激活在抑制NSCLC的發生發展以及腫瘤的治療中起到關鍵作用。我們還觀察到AKT的下游分子之一CREB的磷酸化水平也被藥物抑制，且具有濃度依賴性，CREB調控著上千個下游基因，其中有大量基因的參與腫瘤的發生與進展［25］，所以CREB在腫瘤的發展、維持、進展中起到核心作用，有研究表明［26］，在6種不同類型的NSCLC組織中均檢測出CREB的異常激活，我們推測CREB有可能是治療NSCLC的潛在有效靶點。以上實驗結果提示，去甲澤拉木醛可以作為AKT、CREB的抑制劑有望成為抗腫瘤治療的有前途的候選藥物或者與臨床抗癌藥物聯合治療發揮更好的治療效果。此外，有文獻報道，Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、NF-κB等多條信號通路來啟動和促進EMT［27］。結合以上實驗結果我們推測，去甲澤拉木醛抑制非小細胞肺癌細胞增殖，誘導非小細胞肺癌細胞的凋亡，逆轉EMT的發生可能是通過抑制AKT/CREB信號傳導實現的。

綜上所述，去甲澤拉木醛可抑制非小細胞肺癌A549和H1299細胞的增殖、遷移和侵襲并誘導其凋亡，其作用機制是去甲澤拉木醛抑制了EMT過程和AKT/CREB信號通路，這為尋找非小細胞肺癌治療的潛在靶點提供了實驗依據，也為非小細胞肺癌的治療提供了新的理論依據。