調節腸道菌群可改善卒中后大鼠的神經功能和抑郁癥狀

李新翼，劉玉杰，鄧克崇，胡義奎

武漢市武昌醫院//武漢科技大學附屬武昌醫院，湖北 武漢430061

腦卒中是常見的臨床疾病，卒中后抑郁（PSD）是卒中后最為常見的精神疾病之一，失眠多夢、情緒低落、言語減少、睡眠差等是卒中后抑郁的重要表現，卒中后抑郁不僅嚴重影響患者的生活質量，還可增加后期卒中復發的風險［1］。目前關于卒中后抑郁的發病機制研究并不十分明確。有研究顯示［2-5］，腸道菌群和代謝產物在腦卒中后認知功能中有關鍵作用，腸道菌群代謝產物可加快認知功能障礙的發生，血清中氧化三甲胺（TMAO）水平與抑郁癥正相關；硫化氫（H2S）能夠減弱抑郁癥狀，改善腦卒中損傷。有文獻表明［6-8］，TMAO、H2S在腦損傷中的作用機制存在重合，都與PI3K/AKT、NF-κB信號通路等有關。以上這些研究雖然證明了腸道菌群代謝產物TMAO、H2S參與腦卒中、抑郁的發生，但TMAO/H2S在卒中后抑郁中的作用未見報道。本次研究探討腸道菌群代謝產物TMAO/H2S比值在卒中后抑郁中的作用，為卒中后抑郁患者腸道菌群的干預提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

健康SD大鼠購自于華中科技大學動物實驗中心，清潔級，7～9 周齡，體質量290～310g，許可證：SCXK（鄂）2021—0009；本實驗所涉及的動物實驗方案由武漢市武昌醫院實驗倫理委員會審查并批準。TMAO檢測試劑盒、H2S檢測試劑盒（上海通蔚實業有限公司）；乳酸桿菌（寧波泰斯拓生物技術有限責任公司）；氟西?。ǘY來蘇州制藥）；利福昔明（重慶賽諾生物藥業股份有限公司）；Occludin抗體（Santa Cruz Biotechnology）；caudin-5抗體（affinity）；IgG抗體（Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組處理 本次實驗分成兩部分，第1部分大鼠分為對照組、MCAO組、PSD組，每組15只大鼠；第2部分實驗分為對照組、PSD組、糞便移植組、抗生素組、益生菌組、氟西汀組（陽性組），每組9只大鼠。MCAO組為大腦中動脈栓塞模型；PSD組為卒中后抑郁大鼠模型。糞便移植組大鼠處理方法為：收集對照組大鼠糞便，用0.9%的生理鹽水混合（200 mg/mL），以2000g離心10 min，收集菌液，用滅菌導管從卒中后抑郁大鼠肛門插入5 cm，注射5mL的菌液，保持大鼠倒立5 min，其余大鼠注入等劑量的生理鹽水［9］。益生菌組大鼠處理方法為：卒中后抑郁大鼠每天灌胃乳酸桿菌懸液2 mL（108cfu）［10］?？股亟M大鼠處理方法為：卒中后抑郁大鼠按照150 mg/kg劑量給予利福昔明每天灌胃［11］。氟西汀組大鼠處理方法為：每天給予卒中后抑郁大鼠2.08 mg/kg劑量灌胃［12］。各組大鼠在MCAO術后，每次慢性不可預測輕度應激前，給予上述方法治療和處理，連續處理28 d。

1.2.2 模型構建［13］MCAO模型構建方法如下：用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，分離頸外動脈、右側頸總動脈、頸內動脈，將頸外動脈靠近心臟一端結扎，夾閉頸內動脈，在頸總動脈分叉3 mm位置剪開一個小口，插入栓線，進入頸內動脈，松開頸總動脈夾，使栓線進入大腦的中動脈，90 min后，拔出栓線。將頸外動脈結扎?？p合，消毒。術后24 h，給予神經功能評分，篩選評分在1～3分的大鼠。

卒中后抑郁大鼠模型構建：首先按照MCAO模型構建方法處理大鼠，術后24 h，給予神經功能評分，篩選評分在1～3 分的大鼠，繼續構建卒中后抑郁大鼠模型。給予慢性不可預測輕度應激（28 d），主要有禁水、禁食24 h，限制行為2 h，夜間照明，潮濕墊料，強迫游泳5 min，傾籠7 h，空瓶暴露，暴露異物，每天在這幾種刺激方法中隨機選擇2種。大鼠在進行神經功能評分、糖水偏好度測試、強迫游泳靜止不動時間測試后，采集靜脈血，用于ELISA檢測。斷頭取腦，分離缺血腦組織，用于Western blot檢測。

1.2.3 神經功能評分［12］測定 采用Longa法進行神經功能評分。0分表示無神經缺損；1分表示肢體癱瘓，前側爪不能完全舒展；2分表示行走時出現向肢體癱瘓一側轉圈；3分表示行走時出現向肢體癱瘓一側傾倒；4分表示意識喪失，無法行走。

1.2.4 糖水偏好度檢測 在進行實驗前3 d，在每個籠子內放置1%的蔗糖水適應飼養。1 d后，放置1瓶1%蔗糖水以及1瓶純水24 h。在糖水適應以后，禁食禁水24 h。在每個籠子內放100 mL、1%蔗糖水以及100 mL純水，3 h以后，計算糖水偏好度。糖水偏好度=100%×糖水消耗的體積÷（糖水消耗的體積+純水消耗的體積）。

1.2.5 強迫游泳靜止不動時間 把大鼠放在裝有水的容器內5 min，此時大鼠的腳剛好可以碰到容器的底部。記錄觀察大鼠漂浮在水中不動（頭在水面以上，不掙扎，表現為漂浮狀態）的時長。

1.2.6 TMAO、H2S水平檢測 采用ELISA法檢測大鼠血漿中TMAO、H2S含量，步驟參照TMAO、H2S含量檢測試劑盒。

1.2.7 Occludin、caudin-5、IgG 蛋白表達檢測 采用Western blot方法檢測大鼠腦組織中Occludin、caudin-5、IgG蛋白表達水平。用RIPA裂解液充分裂解腦組織，4 ℃，12 000g離心10 min，取上清，添加上樣Buffer，混合煮沸5 min。選用10%的分離膠和5%的濃縮膠，在每個孔內添加40 μg的蛋白樣品。80 V電壓電泳0.5 h，110V電壓電泳2 h。以300 mA恒流轉膜1.5 h。PVDF膜放在5%脫脂奶粉中，室溫結合2 h。然后將PVDF膜放在一抗內（Occludin、caudin-5、IgG抗體按照1∶500、1∶1000、1∶5000稀釋），在4 ℃過夜反應。最后將PVDF膜放在二抗內，室溫結合2 h。ECL發光。以β-actin作為參照，分析目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值。

1.2.8 統計學分析 數據均利用SPSS21.0軟件統計分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組數據間比較用t檢驗，當Ρ＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卒中后抑郁大鼠TMAO/H2S與神經功能評分、糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間相關性

2.1.1 卒中后抑郁大鼠神經功能評分、糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間 與對照組比較，MCAO組、PSD組大鼠神經功能評分升高，強迫游泳靜止不動時間增加（Ρ＜0.05）；與對照組比較，PSD組大鼠糖水偏好度降低（Ρ＜0.05）；與MCAO組比較，PSD組大鼠神經功能評分升高，強迫游泳靜止不動時間增加，糖水偏好度降低（Ρ＜0.05，表1）。

表1 各組大鼠神經功能評分、糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間比較Tab.3 Comparison of neurological function scores,sugar water preference,and immobility time in forced swimming among different groups of rats(Mean±SD,n=15)

2.1.2 卒中后抑郁大鼠腸道菌群代謝產物TMAO/H2S比值 與對照組比較，MCAO組、PSD組大鼠TMAO水平升高，H2S水平降低，TMAO/H2S比值升高（Ρ＜0.05）；與MCAO組比較，PSD組大鼠TMAO水升高，H2S水平降低，TMAO/H2S比值升高（Ρ＜0.05，表2）。

表2 各組大鼠血漿中TMAO、H2S水平比較Tab.3 Comparison of TMAO and H2S levels in the plasma of the rats(Mean±SD,n=15)

2.1.3 卒中后抑郁大鼠腸道菌群代謝產物TMAO/H2S比值與神經功能評分、糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間相關性分析 卒中后抑郁大鼠TMAO/H2S比值與神經功能評分、強迫游泳靜止不動時間正相關（R2=0.3235，Ρ=0.0269；R2=0.6290，Ρ=0.0004），與糖水偏好度負相關（R2=0.4534，Ρ=0.0059）（圖1）。

圖1 卒中后抑郁大鼠腸道菌群代謝產物TMAO/H2S比值與神經功能評分、糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間相關性分析Fig.1 Correlation analysis between TMAO/H2S ratio of gut microbiota metabolites and neurological function score,sugar preference,and forced swimming immobility time in PSD rats. A: TMAO/H2S ratio is positively correlated with neurological function score. B: TMAO/H2S ratio is negatively correlated with sugar preference. C: TMAO/H2S ratio is positively correlated with the forced swimming immobility time.

2.2 糞便移植對卒中后抑郁大鼠的作用

2.2.1 各組大鼠血漿中TMAO、H2S水平變化 與對照組相比，PSD組大鼠TMAO水平、TMAO/H2S比值均升高，H2S水平降低（Ρ＜0.05）；與PSD組比較，糞便移植組、氟西汀組大鼠TMAO水平、TMAO/H2S比值均降低，H2S水平升高（Ρ＜0.05）；與PSD組比較，抗生素組大鼠H2S水平升高，TMAO/H2S比值降低；與PSD組比較，益生菌組TMAO水平、TMAO/H2S比值均降低（Ρ＜0.05，表3）。

表3 各組大鼠血漿中TMAO、H2S水平比較Tab.3 Comparison of TMAO and H2S levels in the plasma of the rats(Mean±SD,n=9)

2.2.2 各組大鼠神經功能評分比較 與對照組相比，PSD組大鼠神經功能評分和強迫游泳靜止不動時間均升高，糖水偏好度降低（Ρ＜0.05）；與PSD 組比較，糞便移植組、抗生素組、益生菌組、氟西汀組大鼠神經功能評分和強迫游泳靜止不動時間均降低，糖水偏好度升高（Ρ＜0.05，表4）。

表4 各組大鼠神經功能評分、糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間比較Tab.3 Comparison of neurological function scores,glucose preference,and forced swimming immobility time among the groups(Mean±SD,n=9)

2.2.3 各組大鼠腦組織中Occludin、caudin-5、IgG蛋白表達 與對照組相比，PSD組大鼠IgG蛋白相對表達量升高，Occludin、caudin-5蛋白相對表達量降低（Ρ＜0.05）；與PSD組比較，糞便移植組、抗生素組、益生菌組、氟西汀組大鼠IgG蛋白相對表達量降低，Occludin、caudin-5蛋白相對表達量升高（Ρ＜0.05，圖2）。

圖2 各組大鼠腦組織中Occludin、caudin-5、IgG蛋白表達Fig.2 Expression of occludin,caudin-5,and IgG proteins in the brain tissues of the rats in each group.A: Western blots of occludin,caudin-5,and IgG proteins. B: Relative expression level of occludin protein.C:Relative expression level of caudin-5 protein.D:Relative expression level of IgG protein.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs PSD group.

3 討論

腸道菌群通過影響5-HT等因子的合成和利用進而影響抑郁和認知，抑郁癥小鼠的糞便移植到健康正常小鼠后，小鼠可出現抑郁癥狀［2,14］。而TMAO的產生依賴于腸道菌群，卒中后TMAO增多，TMAO被認為是誘導認知障礙的因素之一［15］。H2S是由腸道內的硫酸還原菌代謝后所產生的，卒中后抑郁患者體內H2S水平下降，H2S改善卒中后抑郁可能與額顳葉梗死密切相關［16］。本研究發現，大腦中動脈栓塞、卒中后抑郁大鼠模型TMAO增多，H2S減少，這與之前的文獻相符合，均提示了TMAO、H2S在卒中后抑郁中發揮重要作用。我們還發現，卒中后抑郁大鼠TMAO/H2S比值與神經功能評分、強迫游泳靜止不動時間正相關，且與糖水偏好度負相關。查閱文獻［6-8］發現，TMAO、H2S影響卒中、神經功能的機制存在重合，例如，TMAO激活PI3K/AKT、NF-κB 等影響腦血管損傷；H2S 也可通過PI3K/AKT、NF-κB信號途徑保護缺血性腦卒中神經損傷。TMAO、H2S在卒中后抑郁模型中水平改變，TMAO/H2S比值與卒中后抑郁有關，這可能與TMAO、H2S作用機制有關。

本研究還發現氟西汀、抗生素、益生菌、糞便移植均改善了卒中后抑郁TMAO/H2S比值。既往文獻［17,18］顯示，抗生素利福昔明對腸道菌群和炎癥有改善作用，而抑郁、血腦屏障等與炎癥有關。益生菌乳酸桿菌主要改變了單種菌的豐度和數量，正常大鼠糞便移植能夠直接改變大鼠的腸道菌群［19,20］。氟西汀作為5-羥色胺再攝取抑制劑，可通過改善海馬組織中5-羥色胺的生物合成、利用度以及再攝取缺陷影響抑郁，氟西汀還可以直接影響腸道菌群的豐富［21,22］。結合上述文獻，我們得出結論，氟西汀、抗生素利福昔明、糞便移植可通過影響卒中后抑郁腸道菌群進而改善TMAO/H2S比值，而TMAO/H2S比值又與抑郁癥狀、神經功能相關，進一步證明了氟西汀、抗生素利福昔明、糞便移植再卒中后抑郁中的作用。

血腦屏障與腸道菌群也存在密切關系，無病原供體糞便微生物群可導致無菌小鼠血腦屏障通透性下降，這與腸道中厭氧細菌產生的短鏈脂肪酸有關［23,24］。緊密連接蛋白是血腦屏障的關鍵，Occludin、caudin-5是緊密連接蛋白，因此，Occludin、caudin-5也是維持血腦屏障功能和結構完整的基礎［25-27］。IgG是存在于血清中的免疫球蛋白，正常情況下IgG不能透過內皮細胞連接處，當血腦屏障被破壞時，血液中的IgG才能夠進入腦組織［28-30］。本研究發現，卒中后抑郁大鼠模型腦組織中Occludin、caudin-5 減少，IgG 增多，而糞便移植、益生菌、抗生素利福昔明均可以不同程度的促進Occludin、caudin-5表達，減少IgG表達，這提示改善腸道菌群能夠明顯促進卒中后抑郁大鼠血腦屏障的恢復，結合上述文獻報道，改善腸道菌群可能通過作用于短鏈脂肪酸發揮作用。我們還觀察到糞便移植、益生菌、抗生素利福昔明這3種不同的處理方法對卒中后抑郁大鼠神經功能、抑郁癥狀（糖水偏好度、強迫游泳靜止不動時間）、TMAO/H2S比值、血腦屏障（Occludin、caudin-5、IgG）的影響程度不同，這可能與使用劑量以及其不同的作用機制有關。

綜上所述，本研究證明了腸道菌群代謝產物TMAO/H2S與卒中后抑郁大鼠神經功能、抑郁癥狀相關，改善腸道菌群能夠恢復大鼠血腦屏障，改善神經功能和抑郁，這為腸道菌落干預治療卒中后抑郁提供了數據支撐。