COX6B2 在胃癌組織中高表達并影響患者的遠期預后：基于抑制p53信號調控胃癌細胞的增殖及細胞周期

沈夢迪，趙 娜，鄧曉晶，鄧 敏

1蚌埠醫學院第一附屬醫院消化內科，安徽 蚌埠 233004；2蚌埠醫學院，安徽省生化藥物研究工程中心，安徽蚌埠233030

胃癌是嚴重危害人類健康的消化道腫瘤之一［1-3］。據世界衛生組織統計2020年我國胃癌新發病例數47.9萬，死亡病例數37.9萬，分別占全球胃癌發病和死亡的44.0%和48.6%［4］。目前胃癌的治療方式以外科手術和放化療為主，患者5年生存期限低于30%［5,6］，這可能與腫瘤的失控性增殖、細胞周期紊亂等惡性行為有關［7-9］，深入研究調控這些行為的潛在機制，對胃癌進行靶向治療尤為重要。細胞色素C氧化酶6B2亞基（COX6B2）又稱COXVIB2，是線粒體呼吸復合物IV的編碼亞基，可以加速腫瘤細胞氧化磷酸化和NAD+的生成［10,11］。研究顯示COX6B2在甲狀腺癌、肺腺癌、胰腺癌等組織中表達上調可促進腫瘤的增殖和遠處轉移，與患者遠期預后不良有關［12-15］。然而，COX6B2在胃癌中的潛在作用尚未有相關文獻報道。

本研究利用TCGA和Kaplan-Meier plotter公共數據庫、本機構患者病歷資料嘗試分析COX6B2在胃癌組織中的表達對患者遠期生存的影響，采用生物信息學預測其影響預后的潛在機制并進行體外實驗驗證，旨在探討COX6B2在胃癌中的表達與患者遠期預后之間的關系并分析其對胃癌細胞增殖及周期的影響。

1 資料和方法

1.1 TCGA數據收集和遠期預后在線分析

從美國癌癥基因組圖譜計劃（TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/）下載407例胃癌患者的表達譜信息，其中包括胃癌組織標本375例，正常組織標本32例，用R語言“limma”工具包提取COX6B2基因表達數據并分析其在胃癌和正常胃組織中的表達情況；在Kaplan-Meier plotter在線數據分析平臺檢索COX6B2基因并繪制高低表達組的生存曲線。

1.2 組織標本及臨床資料采集

經患者知情同意后采集胃癌和其毗鄰癌旁組織，將組織標本一分為二，一份固定于中性福爾馬林液中，用于病理學檢測；另一份保存于液氮中，用于分子生物學檢測。收集2014年6月～2017年7月在我院行胃癌根治術的100例患者臨床病理資料，納入標準：患者術后病理診斷為原發性胃癌；患者臨床病歷和病理資料完整；術后隨訪過程完整。排除標準：死于胃癌以外其他因素的患者；合并其他組織起源的惡性腫瘤的患者；因各種原因造成的失訪者。依據以上標準收集患者如下疾病相關資料：住院期間臨床資料：性別、年齡、術后病理診斷、腫瘤分期、腫瘤大小、腫瘤類型等；生存資料：通過電話隨訪確定患者腫瘤相關性死亡是否發生及時間；腫瘤標志物：癌胚抗原（CEA）及糖抗原19-9（CA19-9）。本研究已獲得蚌埠醫學院倫理委員會批準（2019KY030）。

1.3 檢測方法

1.3.1 細胞培養和基因干預 用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640 完全培養基培養胃癌細胞（國家生物醫學實驗細胞資源庫），培養條件為37 ℃、5%CO2。取生長至對數期的胃癌細胞，調整細胞密度為1×105個/mL接種至6孔板中，繼續培養24 h至細胞融合度達到80%后，根據細胞病毒感染復數（MOI）和病毒滴度加入相應體積COX6B2 特異性干擾siRNA（CAGTGTCTAAGCCACGAATAATG）和過表達慢病毒載體感染細胞，感染3 d后用1 μg/mL嘌呤霉素（上海碧云天）篩選穩定沉默和過表達COX6B2的胃癌細胞，收集細胞并用免疫印跡法檢測基因干預效果，當細胞轉染效率達90%以上時可用于后續實驗。

1.3.2 免疫組化檢測 將中性福爾馬林液固定后的胃癌組織進行脫水、浸蠟、石蠟包埋和制成4 μm厚度切片，并置于60 ℃烤片3 h后用二甲苯脫蠟、乙醇水化、枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復、阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶和5%山羊血清封閉。再將一抗COX6B2（1∶200，Proteintech）滴加切片上于4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后孵育二抗，經DAB顯色、蘇木素染核和中性樹脂封片后于400倍顯微鏡下選擇每張切片的5個不重復視野拍照觀察，最后用Image-Pro Plus軟件計算COX6B2蛋白相對積分光密度（IOD）值。以COX6B2 相對表達量IOD值的中位數（4.47）為界將隨訪的100例患者分為COX6B2高表達組（n=50）和低表達組（n=50）。

1.3.3 免疫印跡檢測 取冰凍的胃癌組織和基因干預后的MGC-803細胞以及SGC-7901細胞，經RIPA裂解液裂解提取總蛋白?？偟鞍捉汢CA試劑盒蛋白定量、100 ℃變性10 min和SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，然后用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，4 ℃過夜孵育一抗COX6B2（兔抗人多克隆抗體；1∶1000；Proteintech）和GAPDH（鼠抗人多克隆抗體；1∶1000；Abcam），室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗1 h 后用ECL 發光試劑盒和化學發光成像系統（BioRad）進行曝光，最后用ImageJ軟件測量目標條帶灰度值。

1.3.4 qRT-PCR檢測 將冰凍的胃癌組織經Trizol裂解和勻漿處理后用氯仿、異丙醇和乙醇抽提總RNA，總RNA經NanoDrop?One/OneC微量紫外-可見分光光度計測定濃度和純度后使用RNA 反轉試劑盒（TaKaRa）將RNA逆轉錄為cDNA，以GAPDH為內參在QuantStudio DX 系統進行熒光定量PCR 反應，采用2-ΔΔCt法計算胃癌組織中COX6B2的mRNA相對表達量。使用的引物均由上海生工公司提供，序列如下：GAPDH-forward（5'-3'）：CTGGGCTACACTGAGCA CC，GAPDH-reverse（5'-3'）：AAGTGGTCGTTGAGG GCAATG；COX6B2-forward（5'-3'）：CCCCAAGGGG AAATGGTCG，COX6B2-reverse（5'-3'）：TCTGGTAG CAGTTACGGATCTG。

1.3.5 COX6B2基因富集分析 基于cBio-Portal數據庫（htpps://www.cbioportal.org）共篩選到478 例胃癌標本，其中與COX6B2 共表達的基因數有22 301 個，以Spearman相關性系數絕對值＞0.4為篩選標準，最終獲得與胃癌共表達基因482 個，通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進行基因本體論分析（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集，并將分析結果可視化。

1.3.6 細胞增殖檢測 按照實驗分組將轉染成功的MGC-803和SGC-7901細胞接種于96孔板（2×103個/孔），在37 ℃，5%CO2培養箱中繼續培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑（索萊寶），孵育3 h，最后用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.3.7 流式細胞術檢測 根據實驗分組使用胰酶消化收集轉染成功的MGC-803和SGC-7901細胞于15 mL離心管，經磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，1000g離心5 min，去上清，預冷的PBS重懸并再次沉淀細胞后加入1 mL預冷的70%乙醇固定過夜，離心并用PBS重懸，根據細胞周期檢測試劑盒（上海碧云天）說明書，用0.5 mL碘化丙啶染色液重懸沉淀，37 ℃孵育30 min后立即采用BD 流式細胞儀（FACSCanto）檢測細胞，并使用Flowjo軟件進行細胞周期分析。

1.4 統計學處理

數據分析采用SPSS Statistics 26.0 軟件，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示兩個及以上總體率的比較采用χ2檢驗；K-M生存分析采用Log-rank χ2檢驗；通過Cox比例風險回歸模型分析影響患者術后總生存期的獨立危險因素；采用受試者工作曲線（ROC）分析COX6B2預判胃癌術后患者5年癌性致死的診斷價值；Ρ＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 COX6B2在胃癌中表達上調且與患者預后不良相關

TCGA在線數據庫分析結果顯示，COX6B2基因在胃癌組織中的表達高于癌旁組織（Ρ＜0.05，圖1A）；Kaplan-Meier plotter數據庫分析顯示，COX6B2高表達患者預后較差（Ρ＜0.05，圖1B）。

圖1 TCGA數據庫（A）及Kaplan-Meier plotter數據庫（B）Fig.1 Expression of COX6B2 in gastric cancer tissues and its correlation with long-term prognosis of the patients analyzed using TCGAdatabase(A)and Kaplan-Meier plotter database(B).

2.2 COX6B2蛋白在胃癌組織中高表達

免疫組化、qRT-PCR和免疫蛋白印跡檢測結果顯示，胃癌組織中COX6B2的表達高于癌旁組織（圖2，Ρ＜0.05）

圖2 COX6B2在胃癌組織中的表達Fig.2 Expression of COX6B2 in gastric cancer tissues.A:Immunohistochemical staining of COX6B2.B:Relative IOD value of COX6B2.C:mRNA level of COX6B2 detected by RT-qPCR.D:Protein level of COX6B2 detected by Western blotting.E:Quantitative analysis of relative expression of COX6B2.*P＜0.05 vs Normal.

2.3 胃癌組織中COX6B2表達量與外周血CEA、CA19-9正相關

胃癌組織中COX6B2相對表達量與外周血腫瘤標記物CA19-9（r=0.655，Ρ＜0.05，圖3A）、CEA（r=0.592，Ρ＜0.05，圖3B）均呈現正相關。

圖3 胃癌組織中COX6B2表達量與外周血CEA、CA19-9的相關性Fig.3 Correlation of the expression level of COX6B2 in gastric cancer tissues with CEA(A)and CA19-9 in peripheral blood(B).

2.4 胃癌組織中COX6B2表達量與臨床病理指標相關

COX6B2表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小和癌細胞類型間的差異均無統計學意義（Ρ＞0.05）。與COX6B2低表達組相比，COX6B2高表達患者比例在CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T分期為3～4期及N分期為2～3期的胃癌患者中更高（Ρ＜0.01，表1）。

表1 胃癌組織中COX6B2表達量與臨床病理指標間關系Tab.3 Correlations of COX6B2 expression level with clinicopathological indexes of patients with gastric cancer[n(%)]

2.5 COX6B2蛋白表達量影響患者遠期預后

K-M生存曲線顯示，COX6B2高表達組患者5年生存率低于COX6B2低表達組（Ρ＜0.01，圖4）。

圖4 胃癌組織中COX6B2表達量與患者遠期預后之間的關系Fig.4 Correlation of the expression level of COX6B2 in gastric cancer tissues with longterm prognosis of the patients.

2.6 COX6B2是胃癌根治術5年生存期的獨立危險因素

COX6B2高表達、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T分期為3～4期和N分期為2～3期是胃癌根治術5年生存期的影響因素（Ρ＜0.05，表2）。以單因素分析的陽性結果為自變量，5年生存情況為因變量進行多因素COX比例風險回歸分析顯示，以上因素均為預測患者術后5年生存期的獨立危險因素（Ρ＜0.05，表2）。

表2 影響胃癌根治術5年生存期的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analyses of the factors affecting 5-year survival of gastric cancer patients after radical gastrectomy

2.7 COX6B2蛋白表達量可預判患者術后5年生存期

ROC分析結果顯示，以COX6B2相對表達量4.55為截點值預判胃癌患者術后5 年生存期的敏感性為86.96%，特異性為72.22%，曲線下面積為0.816（Ρ＜0.01，圖5）。

圖5 COX6B2表達量對預判患者術后5年生存期的價值Fig.5 Value of COX6B2 expression for predicting 5-year survival of gastric cancer patients after gastrectomy.

2.8 COX6B2共表達基因富集并通路分析

KEGG-pathway和GO富集分析顯示，COX6B2可能參與細胞周期的調節過程，并可能與p53信號通路相關（圖6）。

圖6 COX6B2基因KEGG和GO的富集分析Fig.6 KEGG and GO enrichment analysis of COX6B2.A:GO enrichment analysis of COX6B2 in gastric cancer;B:KEGG enrichment analysis of COX6B2 in gastric cancer.

2.9 COX6B2參與調控胃癌細胞周期并促進其增殖

免疫印跡實驗結果顯示，胃癌細胞MGC-803轉染成功（圖7A、B，Ρ＜0.05）；流式細胞術結果顯示，與Control組相比，下調COX6B2后胃癌細胞周期發生G1期阻滯，上調后則相反（圖7C、D，Ρ＜0.05）；CCK-8檢測結果顯示，COX6B2可以顯著促進胃癌細胞的增殖能力（圖7E，Ρ＜0.05）。結果在胃癌細胞株SGC-7901細胞中同樣適用（圖7F～J）。

圖7 COX6B2對胃癌細胞增殖和周期的影響Fig.7 Effect of COX6B2 on proliferation and cell cycle of MGC-803 cells. A, B: Expression of COX6B2 detected by Western blotting in MGC-803 cells. C, D: Flow cytometric analysis of percentage of G1/S phase cells in MGC-803 cells.E:CCK-8 assay of the proliferation of MGC-803 cells.F,G:Expression of COX6B2 detected by Western blotting in SGC-7901 cells.H,I:Percentage of G1/S phase cells detected by flow cytometry in SGC-7901 cells.J:CCK-8 assay of proliferation of SGC-7901 cells.*P＜0.05 vs control.

2.10 COX6B2參與調控胃癌細胞周期并促進其增殖

免疫印跡分析顯示，與Control 組相比，上調COX6B2 抑制胃癌細胞中p53 和p21 的表達，下調COX6B2 則促進胃癌細胞中p53 和p21 的表達（圖8，Ρ＜0.05）。

圖8 COX6B2對胃癌細胞p53信號的影響Fig.8 Effect of COX6B2 on p53 signaling in gastric cancer cells.A,B:Expression of p53 and p21 in MGC-803 cells.C,D:Expression of p53 and p21 in SGC-7901 cells.*P＜0.05 vs control.

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤［16］，由于缺乏早期診斷指標，一旦被確診時大多處于中晚期，導致大多數患者預后欠佳［17,18］。因此明確胃癌的發生發展機制，尋找特異性評估遠期預后的生物指標，對優化患者治療方案，提高5年生存期有重大意義［19］。研究發現，COX6B2在多種類型腫瘤組織中高表達，并與腫瘤細胞的惡性生物學行為（增殖、侵襲、遷移及凋亡等）息息相關。例如COX6B2可以通過促進細胞氧化磷酸化，從而加速胰腺癌細胞轉移進程［13］；同時，COX6B2在肺癌中高表達，并可以促進人肺腺癌細胞的氧化磷酸化、增殖等惡性行為［20］。以上研究初步證實了以COX6B2為靶點可能是腫瘤早期診斷以及腫瘤后期治療的可行策略。然而，COX6B2在胃癌中的表達情況以及對胃癌細胞的可能調控作用目前尚無研究報道。本研究通過收集本機構病例信息以及患者標本組織進行分析，發現COX6B2在胃癌組織中高表達且與胃癌患者預后不良有關。并進一步采用生物信息學工具挖掘TCGA 和Kaplan-Meier plotter公共數據庫彌補本機構數據量偏小的局限性，同時應用生物信息學分析COX6B2影響胃癌患者預后的可能機制并在細胞水平上加以驗證，初步探明了COX6B2影響胃癌患者預后的分子機理。

為探究COX6B2 在胃癌中表達水平，我們對TCGA數據庫中患者表達譜信息進行分析，并采用免疫組化、免疫印跡等分子生物學方法驗證，發現COX6B2在胃癌組織中表達增高。目前尚未有研究闡明COX6B2表達量與胃癌病理指標間關系，CEA是出現在胎兒時期的含多糖復合物，CA19-9是一種黏蛋白型的糖類蛋白，二者在消化系統腫瘤的診療、預后等多個方面有重要指示作用［21,22］，本研究結果顯示COX6B2在胃癌組織中高表達促進腫瘤進展且與CEA和CA19-9正相關。此外，COX6B2高表達患者生存率明顯低于COX6B2低表達患者，提示COX6B2高表達可能與胃癌患者預后不良相關。研究顯示COX6B2影響胰腺癌患者總生存期和無病生存期［13］，這在胃癌的研究中也得到了證實。最后，多因素COX回歸分析證實COX6B2是影響胃癌患者預后不良的獨立因素。胃癌早期癥狀不典型，進展較快，尋找評估及監測患者病情進展的生物標志物尤為重要［23,24］，而本研究結果提示COX6B2可能具備作為腫瘤標志物的能力，并為胃癌的臨床干預提供了新的靶點。

以上研究結果證明COX6B2在胃癌組織中的高表達參與胃癌的病理過程并影響患者遠期預后。新近研究發現細胞色素c氧化酶與其他核編碼蛋白構成氧化還原反應活性中心，其功能缺陷會導致線粒體的功能障礙，促進神經退行性病變的發生［25,26］，還可以通過調節PPAR 信號通路促進脂肪代謝，抑制肥胖［27］。另外，COX6B2被證實與一些腫瘤的惡性進展相關，可以通過靶向ATP/purinergic受體調節線粒體功能來促進胰腺癌的轉移，是分化型甲狀腺癌遠處轉移的新型生物標志物［13,15］，但其對胃癌的作用尚且不知。我們對公共數據庫富集發現COX6B2可以調控胃癌細胞周期。接下來采用慢病毒轉染方式干擾MGC-803 和SGC-7901 中COX6B2 表達，CCK-8 和細胞周期檢測顯示過表達COX6B2可促進細胞增殖且G1/S期細胞比例顯著增加，提示COX6B2可能通過調控細胞周期影響胃癌惡性增殖過程。這一結果開辟了COX6B2調控腫瘤進展的途徑，為日后COX6B2功能研究了提供新視角。為進一步闡釋COX6B2作用于胃癌細胞的機制，我們通過KEGG 富集分析COX6B2 作用于胃癌細胞可能于p53信號通路相關。p53是一種腫瘤抑制蛋白，可調節多種基因的表達，這些基因參與細胞凋亡、生長停滯、抑制細胞周期進程、分化和加速DNA修復或衰老，以應對基因毒性或細胞應激［28,29］。作為轉錄因子，p53可激活上百種基因表達，這些靶基因直接參與細胞周期的調控、DNA損傷的修復，也與細胞衰老、分化及細胞凋亡有關［30,31］。而p21是P53的靶點，它依賴于P53的活性。故我們檢測了胃癌細胞中p53及p21的蛋白水平，研究結果顯示COX6B2可以顯著抑制p53信號通路的活化，提示COX6B2可能是通過抑制p53信號通路發揮作用。

本研究存在以下不足之處：本文為回顧性研究，胃癌患者樣本量有限，后期還需納入大量患者臨床病歷資料進行統計分析。納入研究患者的特征具有異質性。本研究發現COX6B2可能通過調控細胞周期影響胃癌的惡性增殖，但COX6B2功能復雜，日后還需要對其進行更加深入全面的研究。

綜上所述，COX6B2可能是新型的腫瘤標記物，其在胃癌組織中的高表達可能通過調控細胞周期來影響腫瘤的失控性增殖，進而影響患者遠期預后。因此監測血清COX6B2的水平對評估患者遠期預后具有重要臨床意義。