帕瑞昔布鈉改善腹腔鏡下直腸癌根治術患者的炎癥微環境并促進患者恢復：基于下調CXCL8-CXCR1/2表達

武若杰，劉 睿，張一粟，李曉紅

蚌埠醫學院第一附屬醫院麻醉科，安徽 蚌埠233000

結直腸癌（CRC）是我國消化道中常見的惡性腫瘤之一，截止2022年數據顯示結直腸癌發病率居惡性腫瘤第2位，病死率居惡性腫瘤第4位，中國結直腸癌的發病率和死亡率顯著增加［1］。腫瘤轉移是患者死亡的主要原因之一，是一個涉及多因素的復雜過程［2］。研究發現轉移發生的前源是原發部位腫瘤或轉移部位的循環腫瘤細胞（CTC）［3］。CTC與腫瘤微環境（TME）有密不可分的關系，TME促成了CTC的發生和演變［4］。TME是指腫瘤或癌癥干細胞所處的細胞環境，其組成的標志性特征包括免疫細胞、基質細胞、血管及細胞外基質［5］。TME對腫瘤原發部位的進展和侵襲產生影響，對腫瘤轉移具有一定的促進作用［6］。

多項研究均探討了TME與轉移的關系［7,8］，趨化因子及其受體廣泛表達于多種類型腫瘤細胞中，能夠對腫瘤的發展和侵襲產生影響［9］。CXCL 8作為腫瘤相關中性粒細胞的趨化劑，在TME中促進血管形成，為腫瘤生長轉移提供基礎［10］。CXCL8-CXCR1/2 軸可以干擾TME中的細胞分化與功能，最終在腫瘤微環境中對癌癥的增殖、血管分化、侵入和轉移有不同的影響［11-13］。

帕瑞昔布鈉是一類非甾體類抗炎藥物，主要通過降低環加氧酶-2（COX-2）來減少中樞和外周的前列素生成，從而抑制炎癥介質的產生與炎癥反應［14］。帕瑞昔布鈉對圍術期腫瘤患者的影響作用，主要表現在減輕術后疼痛、抑制炎癥反應［15］、保護免疫功能，抑制腫瘤復發［16］；但是帕瑞昔布鈉對腹腔鏡下直腸癌根治術患者TME中CXCL8-CXCR1/2軸影響尚未見報道。本研究通過觀察帕瑞昔布鈉對腹腔鏡下直腸癌根治術患者圍術期CXCL8，CXCR1，CXCR2 的影響，明確帕瑞昔布鈉對在圍術期TME的調控作用及機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

2022年7月～2023年2月共60例患者納入了試驗，均為同一組胃腸外科醫生治療的腹腔鏡下直腸癌根治術（采用Miles術式）患者。采用隨機數字表法分為對照組、試驗組，每組30例。本研究獲得蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會的批準（倫理批號：2023YJS213）。

1.1.1 診斷標準 參照《結直腸癌診療規范（2020 年版）》，所有入組病例均已進行結腸鏡、腹部盆腔及雙肺增強CT、核磁共振成像及病理檢查確診為直腸癌。

1.1.2 納入標準 美國麻醉醫師協會（ASA）分級Ⅰ級～Ⅲ級；年齡40～64歲，不限制性別；入組患者體質量指數（BMI）：20～30 kg/m2；患者和（或）其授權委托人知情本研究涉及藥物及其風險后，同意并簽署本研究知情同意書。

1.1.3 排除標準 患者合并其他臟器（如心、腦、肝、腎等）嚴重病變或者與手術相關禁忌證；患者直腸癌已發生臨床遠處轉移；經過免疫抑制劑、放療及新輔助化療的患者；患有其他腫瘤疾病史和（或）已經加入其他任何類型研究；對帕瑞昔布鈉過敏或依從性差的患者。

1.2 試劑

人白細胞介素-8（CXCL 8）ELISA 試劑盒（上海磐超生物科技有限公司）；人白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（上海磐超生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海磐超生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM 培養基、RPIM 1640 培養基、胎牛血清（FBS），胰酶（碧云天生物技術研究所）；電泳液（天地人和/MOPS Running Buffer(1L)/B23 021405；轉膜液（Y-Tec快速轉膜液20x/YWT0500）；脫脂奶粉（BD Difco/1053907）；BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；PVDF 膜（Bioshrap）；鼠抗人CXCL8單克隆抗體、鼠抗人CXCR1，CXCR2 單克隆抗體、辣根過氧化酶標記山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（Affinity）；ECL 化學發光試劑盒，RIPA裂解液（北京康為世紀生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑盒，即用型SABC（小鼠抗兔IgG）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 分組處理

采用雙盲、前瞻性、隨機對照的研究方法，以1∶1進行隨機對照研究，采用隨機數字表法將60例患者隨機分為2組（每組30人）：對照組（A組）和試驗組（B組），均實施全身麻醉，試驗組分別于全身麻醉誘導開始時（T1）、術后即刻（T2）、術后12 h（T3），將帕瑞昔布鈉40 mg融入20 mL 生理鹽水中稀釋后緩慢靜脈注射；對照組以同方法給予等容量生理鹽水。

1.4 麻醉方法

1.4.1 麻醉前訪視 所有患者術前常規禁食8 h、禁飲4 h及腸道準備，無術前用藥。

1.4.2 術中麻醉管理 入室后，核對患者信息進行外周靜脈開放，監測ECG、SpO2、BP和BIS麻醉深度?；颊咄ㄟ^改良Allen 試驗后，進行橈動脈穿刺置管并在術中持續監測血壓。麻醉誘導：咪達唑侖注射液0.02～0.05 mg/kg，枸櫞酸舒芬太尼注射液0.25～0.5 μg/kg，依托咪酯0.2～0.4 mg/kg，順式阿曲庫銨0.2～0.3 mg/kg，3 min后插入氣管導管，連接呼吸機，調節呼吸參數（呼吸頻率12～16次/min，潮氣量8～10 mL/kg、吸呼比1∶2，PetCO2維持在35～45 mmHg，氧流量1.0～2.0 L/min）。麻醉維持：采用吸入1%～2%七氟醚、泵注丙泊酚4～8 mg/（kg·h）、瑞芬太尼0.4～0.7 μg/（kg·h）、順式阿曲庫銨0.1 mg/（kg·h），BIS維持在40～60。B組分別于全身麻醉誘導開始時（T1）、術后即刻（T2）、術后12 h（T3）給予帕瑞昔布鈉40 mg融入20 mL 生理鹽水中稀釋后緩慢靜脈注射，A組以同方法給予等容量生理藥水。

1.4.3 術后鎮痛管理 鎮痛泵配比方案：100 μg枸櫞酸舒芬太尼注射液和5 mg鹽酸托烷司瓊注射液，用生理鹽水稀釋到100 mL。參數：單次脈沖式輸注2 mL藥液，連續輸注速度1.5 mL/h，自動鎖定時間30 min。鎮痛泵在術后48 h后回收。

1.5 觀察指標

1.5.1 主要觀察指標 ELISA測定血漿中炎癥因子IL-6，TNF-α，CXCL8 的含量取患者于T1、T2、T3、T4的外周靜脈血用于ELISA檢測。嚴格按試劑盒說明書的操作進行。

Ficoll-Hypaque 密度梯度分離法分離人外周血單個核細胞分離過程在室溫下進行，在15 mL離心管中含Ficoll-Hypaque 分離液3 mL，取血樣標本3 mL與等量生理鹽水3 mL混合吹打均勻，將此混合液加入Ficoll-Hypaque 分離液的液面上，2000 r/min離心20 min。離心后可見離心管內大致分3 層，在上、中層界面處有一白色云霧帶(以外周單個核細胞為主)，輕柔吸取云霧層，收集外周單個核細胞層。利用生理鹽水洗細胞2 次，置于15 mL離心管中，加入5倍以上生理鹽水，10 000 r/min離心1 min，收集沉淀細胞，用RPMI 1640 完全培養液稀釋至懸浮細胞至1×106個/mL。

Western blot 檢測外周單個核細胞（PBMCs）中CXCL8，CXCR1和CXCR2 蛋白表達和含量，提取蛋白質過程中，使用RIPA 細胞裂解緩沖液裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，提取細胞總蛋白后利用BCA法測量計算，5 倍SDS 上樣緩沖液與100 μg蛋白質按比例混合，100 ℃水浴加熱5 min，用10%經凝膠電泳分離后轉膜，后用5%脫脂奶粉封閉2 h；按說明書用一抗4 ℃孵育過夜；用二抗37 ℃輕搖，室溫孵育2 h，將洗膜晾干后加入ECL工作液顯色，曝光、顯影。用Biorad Image Lab 圖像分析系統，分析各條帶的灰度值并記錄。

1.5.2 其他觀察指標 術前兩組患者的一般基線資料，包括：年齡、術前ASA分級、術前既往史等信息；術中資料包括：手術時長、麻醉用藥和鎮痛藥的使用量；術后資料包括：在術后12 h、術后24 h時刻患者的VAS評分，術后胃腸道不良反應、隨訪資料。隨訪時間為6個月，依據患者手術后時間進行術后檢查，腫瘤發生發展的結果依據復查的影像學檢查定性為轉移或者復發。

1.6 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件處理，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用成組t檢驗，組內比較采用重復測量的方差分析。使用GraphPad Prism9.0 進行數據分析驗證和作圖。Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的臨床資料及術中資料比較

兩組患者在年齡、性別、術前已確診合并癥、ASA分級、患者術中靜脈麻醉藥用量、鎮痛藥物用量的差異均無統計學意義（Ρ＞0.05，表1）。

2.2 兩組患者的炎癥指標含量比較

與對照組比較，術后即刻、術后12 h 和術后24 h試驗組血漿中IL-6、TNF-α、CXCL 8含量均明顯減少（Ρ＜0.05，圖1）。

圖1 兩組患者不同時間點血漿白介素-8(A)、白介素-6(B)及腫瘤壞死因子-α(C)水平比較Fig.1 Comparison of plasma interleukin-8(A),interleukin-6(B) and tumor necrosis factor-α (C) levels at different time points between the two groups (Mean ± SD).Group A:Control group;Group B: Experimental group;T1: Before operation.T2: Immediately after operation;T3: 12 h after operation;T4: 24 h after operation.*P＜0.05,**P＜0.01 vs GroupA.

2.3 兩組患者PBMCs中CXCL 8、CXCR1和CXCR2蛋白表達水平的比較

與術前時刻相比，CXCL 8、CXCR1和CXCR2蛋白表達量處于上升階段（Ρ＜0.05）；于術后即刻、術后12 h、術后24 h試驗組蛋白表達的上調程度較對照組上調程度均明顯降低（Ρ＜0.05，圖2），CXCR2 表達的上調程度明顯較CXCR1 上調程度低。

圖2 帕瑞昔布鈉對兩組患者PBMCs中CXCL8,CXCR1,CXCR2蛋白表達量的影響Fig.2 Effect of parecoxibuna on CXCL8,CXCR1,and CXCR2 protein expressions in PBMCs in the two groups.A:Protein expressions of CXCL-8,CXCR-1 and CXCR-2 determined by Western blotting.B-D:Quantitative analysis of protein expressions relative to GAPDH.Group A: Control group;Group B: Experimental group;T1: Before operation.T2:Immediately after operation;T3:12 h after operation;T4:24 h after operation.*P＜0.05,**P＜0.01 vs GroupA.

2.4 兩組患者術后VAS評分比較

與對照組比較，術后12 h和術后24 h試驗組患者術后VAS評分均明顯減少（Ρ＜0.05），但在術后即刻兩組患者VAS評分無明顯差異（Ρ＞0.05，圖3）。

圖3 兩組患者圍術期各時間點VAS評分的比較Fig.3 Comparison of VAS scores at different perioperative time points between the two groups.T1: Before operation.T2: Immediately after operation;T3: 12 h after operation;T4: 24 h after operation.*P＜0.05 vs GroupA.

2.5 術后資料比較

B組應用帕瑞昔布鈉的患者術后住院時長較A組更短，差異有統計學意義（Ρ＜0.05，表2）。兩組患者在術后胃腸道術后并發癥方面比較，差異有統計學意義（Ρ＜0.05，表2）。對兩組患者術后6個月隨訪發生腫瘤轉移人數統計，對照組較試驗組多，但差異無統計學意義（Ρ＞0.05）。

表2 兩組患者術后數據比較Tab.3 Comparison of postoperative data between the two groups

3 討論

本試驗主要研究帕瑞昔布鈉對腹腔鏡下直腸癌根治術患者圍術期TME 影響及作用機制。研究結果表明，應用帕瑞昔布鈉能夠下調腹腔鏡下直腸癌根治術患者炎癥指標、減輕術后疼痛、減少術后胃腸道不良反應減少住院時長，其對患者圍術期TME產生影響的作用機制可能與下調CXCL8-CXCR1/2表達有關。

在TME中，癌癥干細胞、調節免疫細胞、基質細胞等之間相互作用，積極重新配置TME成分進而實現腫瘤穩態［17］。趨化因子是一種擁有復雜結構的小分泌蛋白，在TME中由不同的腫瘤細胞和基質細胞表達并產生影響［18］。趨化因子在炎癥和免疫過程中起著至關重要的作用［19］。CXCL8 是提取自人外周單個核細胞（PBMCs）的可作為關鍵的多功能趨化因子，調節腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移，作為患癌患者的免疫抑制成分，導致患者預后不良［20］。研究證明IL-6、CXCL 8在介導先天免疫反應的細胞中起主要作用，在轉移性定植中發揮關鍵性作用［21］。本研究經ELISA 測定兩組腹腔鏡下直腸癌根治患者血漿中IL-6、TNF-α、CXCL 8含量，發現應用帕瑞昔布鈉的試驗組較對照組的炎癥因子含量均顯著降低，證明帕瑞昔布鈉可以很好的抑制腹腔鏡下直腸癌根治術患者圍術期炎癥因子的釋放。本研究中應用帕瑞昔布鈉的試驗組較對照組對降低術后CXCL 8的含量有顯著效果，而通過降低術后機體產生的CXCL 8能夠對圍術期TME乃至患者臨床結果產生影響。有研究證明CXCL8上調會促進結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，對TME穩態產生影響［22］。

本研究發現，試驗組術后12、24 h的VAS評分均顯著低于對照組。說明帕瑞昔布鈉能更好的減輕患者術后疼痛，從而有效的阻止了術后炎癥細胞動員和炎癥因子爆發，降低患者術后應激反應。帕瑞昔布鈉作內首選的非腸外選擇性COX-2抑制劑，有可降低血小板聚集和減輕胃腸功能不良反應的優點［23］。結合本研究對兩組患者術后胃腸道不良反應統計，可見試驗組較對照組能明顯降低腹腔鏡下直腸癌根治術患者術后的胃腸道不良反應。帕瑞昔布鈉可通過下調促炎因子水平，而上調抗炎因子水平達到減輕腸道損傷的目的［24］。在本研究中應用帕瑞昔布鈉可明顯減少患者術后炎癥因子同時減少術后疼痛，從而共同作用達到促進患者術后胃腸道功能恢復作用。試驗組患者的住院時間明顯低于對照組，證實應用帕瑞昔布鈉能減輕腹腔鏡下直腸癌根治術患者手術創傷帶來的不良反應，促進患者術后恢復。而有研究證明腫瘤微環境促進COX 2表達的增加，為腫瘤發生發展提供遷移和侵襲的可能［25］。帕瑞昔布鈉的應用一定程度上可改善淋巴細胞亞群和NK細胞亞群的免疫功能，并延緩腫瘤的復發［26］。結合以上及本研究結果證實了帕瑞昔布鈉通過降低腹腔鏡下直腸癌根治術患者術后產生的炎癥反應，減輕術后疼痛，從而加速術后免疫功能恢復、改善圍術期腫瘤微環境變化。

CXCL8-CXCR1/2軸已證實在誘導腫瘤細胞進展和TME重塑中產生重要促進作用［27］。研究利用Western blot 分別檢測腹腔鏡下直腸癌根治術患者圍術期外周單個核細胞（PBMCs）中CXCL8，CXCR1/CXCR2 蛋白表達和含量，數據結果上看出，試驗組CXCL8，CXCR1和CXCR2 蛋白表達水平的上調程度較對照組蛋白上調程度在術后即刻、術后12 h、術后24 h均顯著降低，說明帕瑞昔布鈉通過下調腹腔鏡下直腸癌根治術患者圍術期外周單個核細胞（PBMCs）中趨化因子配體CXCL8及受體CXCR1/CXCR2 的表達，在研究中證實利用下調CXCL 8-CXCR1/2表達能阻止腫瘤干細胞異質性，同時發現CXCR1表達與淋巴結轉移之間存在顯著關聯［28］。在以上報道中可證實，下調CXCL8-CXCR1/2軸的表達是能夠對腫瘤的發生發展產生影響的并能夠作用TME。國外一項研究也證明使用新型動物模型的數據，CXCL 8/CXCR2在TME中的表達在結腸癌生長，進展和轉移中起著關鍵作用［29］。結合研究中直腸癌患者術后疼痛減輕、術后胃腸道功能恢復加快及住院時長減少的結果，帕瑞昔布鈉可能是通過減少趨化因子CXCL 8配體與受體的量，使得炎細胞在腫瘤微環境的過度趨化減輕，從而能進一步減輕炎細胞乃至患者術后的氧化應激及減輕術后疼痛而得以對圍術期腫瘤微環境產生一定影響，同時對趨化因子產生影響進而對患者圍術期免疫功能產生作用。近期最新研究證實，帕瑞昔布鈉可通過抑制人結直腸癌連環白量的下調來抑制EMT和轉移，從而達到抗腫瘤轉移的作用［30］。結合本研究兩組患者術后6個月隨訪的腫瘤發生發展情況，對照組發生轉移患者數目是多于試驗組。帕瑞昔布鈉可通過減少圍術期趨化因子配體和受體的量從而改善趨化因子對圍術期腫瘤微環境所帶來的不利影響，維持TME穩態。

本研究存在一些局限性。首先，我們只是對術后24 h內進行了評估和觀察，可觀察到炎癥水平在術后24 h逐漸達到高峰，術后3～7 d或更久可能觀察到圍術期的炎癥水平改變、免疫抑制現象、胃腸道不良反應的發生。同時隨訪時間僅僅在術后6個月內，對患者腫瘤發生發展無法準確評估，隨訪時間在3～5年可能獲得更準確的結果。再者，本文研究的僅是在血液中趨化因子指標而并未對腫瘤局部部位的趨化因子及TME細胞組成進行研究，因此本研究的統計效力有限需要更多時間并進一步對腫瘤組織局部炎癥產生和炎細胞趨化進行研究，后續需要在細胞及作用位點方面繼續研究。

綜上所述，帕瑞昔布鈉能顯著降低腹腔鏡下直腸癌根治術患者術后血漿中炎癥因子、炎癥指標，減輕術后疼痛，減少胃腸道術后不良反應進而促進患者術后胃腸道恢復，減少住院時間。帕瑞昔布鈉能夠減慢腹腔鏡下直腸癌根治術患者腫瘤轉移，改善圍術期腫瘤微環境穩態，其機制可能與下調CXCL8、CXCR1 和CXCR2 蛋白表達，減少IL-6、TNF-α、CXCL 8的合成與分泌，減弱患者圍術期腫瘤微環境中炎細胞的趨化反應，減輕術后疼痛及圍術期炎癥應激反應有關。