甜菜單胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B 的選育

付增娟 王 良 趙尚敏 鄂圓圓 張自強 李曉東 張必周白 晨 鄭文哲 索寧寧 周曉華 孫夢媛 張惠忠 張 輝

（1.內蒙古自治區農牧業科學院特色作物研究所/內蒙古自治區甜菜品種遺傳改良與種質創制重點實驗室 內蒙古呼和浩特 010031；2.赤峰市巴林左旗農牧技術推廣中心 內蒙古赤峰 024000）

甜菜是世界上最重要的兩大糖料作物之一，選育性狀優良、抗病、適宜機械化作業、單胚率高、雄性不育的種質及單胚雄性不育雜交種是現代甜菜育種的主攻方向和主導趨勢。 利用核質互作型雄性不育系與授粉系間進行雜交獲得最大程度的雜種優勢以提高甜菜的產量水平和品質水平， 而單胚種的特性既能滿足種子丸?；募庸ば枨?， 利于機械化作業實施，又能減少勞動用工，同時也是推廣甜菜紙筒育苗、精量播種、節水灌溉、機械化管理等配套綜合栽培設施的基礎， 因而單胚雄性不育雜交種可使甜菜綜合經濟效益得以提升[1]。

細胞質雄性不育（CMS）是植物普遍存在的一種現象，在生產應用與基礎研究中具有顯著優勢，成為科學研究的熱點。甜菜細胞質雄性不育（CMS）選育是當代甜菜育種的核心技術[2]，作為甜菜雜交種最主要的骨干親本材料， 其選育進程直接決定了甜菜新品種的創制。 歐美國家早已不使用產量偏低的甜菜多胚品種， 利用單胚雄性不育的高產優質型品種是當今世界甜菜育種的主流， 也是我國甜菜育種的主攻目標。 利用單胚雄性不育系配制雜交種的優點是制種省力、雜交率高、原種可控、雜種高產、單胚種子便于機械化精量點播和紙筒育苗移栽[3]。 如何快速準確選育出優異親本材料配制出優良雜交組合是新品種選育的關鍵。 甜菜屬于二年生異花授粉作物，種質資源鑒選、親本材料選育、雜交組合配制等各環節選育進程均較其他一年生作物繁復， 尤其對于核心親本甜菜單胚雄性不育系選育更為復雜， 一年生營養生長階段的農藝性狀、 二年生生殖生長階段的農藝性狀、 配合力高低等諸多性狀均需依據育種目標審慎考慮。 本文作者對甜菜單胚雄性不育系NM3005A 選育過程中的主要育性、 胚數性、 配合力、 抗叢根病性、 細胞質類型、 花藥和花粉表型等重要性狀進行了闡述。

1 親本來源

甜菜單胚雄性不育系NM3005A 是內蒙古農牧業科學院甜菜育種創新團隊2013 年6 月以從多胚授粉系HBB-1 繁殖田中發現的雄性不育株為母本，以從美國引進的單胚材料960767 和內蒙古農牧業科學院自育的抗叢根病材料N98122 雜交改良出的單胚育種材料為授粉系進行多代回交選育而成。

2 選育過程

2013 年采取人工授粉套紙袋雜交的方法， 對發現的雄性不育單株用改良創制出的單胚保持系進行雜交，收獲F1種子；同年進行南育加代。

2014-2020 年采用成對套袋方法進行回交選育，不育系NM3005A 在育性表型鑒定中， 完全不育型和半不育Ⅰ型不育株率由61.90%提升至98.00%（表1）；在胚數性表型鑒定中， 單胚率由最初的0 提升至98.00%（表2），期間根據育種目標對其產量性狀、品質性狀、抗病性等進行選擇，收獲BC1F1～BC4F1代種子。

表1 單胚雄性不育系NM3005A 選育育性表現

表2 單胚雄性不育系NM3005A 選育胚數性表現

2021-2022 年進行產量、品質、抗叢根病性、配合力等試驗鑒定。在2 年的產量、品質水平鑒定中，甜菜單胚雄性不育系NM 3005A的平均產量62 460.00 kg/hm2，平均含糖率15.80%，平均產糖量9 868.68 kg/hm2，產糖量較對照雜交品種KWS1197 （CK） 降低19.74%；甜菜單胚雄性不育保持系NM3005B 平均產量55 920.00 kg/hm2，平均含糖率15.51%，平均產糖量8 673.19 kg/hm2， 產糖量較對照雜交品種KWS1197降低29.46%（表3）。

表3 NM3005A 及NM3005B 的產量、品質鑒定結果

抗叢根病性鑒定試驗在內蒙古農牧業科學院甜菜叢根病病圃中進行，甜菜單胚雄性不育系NM3005A叢根病病情指數為25， 單胚雄性不育保持系NM3005B 叢根病病情指數為28，為中抗抗叢根病類型，叢根病病情指數較對照雜交品種（CK）分別降低4 和1，表現出較強的抗性（表4）。

采用不完全雙列雜交法進行配合力測定， 以自育多胚種品系NR-Z1、N98122、N98122×NR-Z1、HBI-1、NR-Z3-3 為測驗種， 對NM3005A 等5 個單胚雄性不育系進行根產量配合力測定。 結果表明，單胚雄性不育系NM3005A 根產量一般，配合力（GCA）為最高，一般配合力效應值為1.47，表現出較高的一般配合力（表5）。

表5 單胚雄性不育系NM3005A 根產量一般配合力測定

3 成系鑒定

3.1 育性和單胚性表型鑒定

不育系NM3005A 及保持系NM3005B 二年生生殖生長階段育性、胚數性鑒定試驗于2023 年4 月在內蒙古呼和浩特市和林格爾縣單胚雄性不育系成系鑒定圃進行，成系鑒定不育系及保持系按1∶1 比例分行栽植，每個材料栽植100 株，株行距40 cm×60 cm。在甜菜盛花期， 由內蒙古自治區農牧業科學院組織， 聘請哈爾濱工業大學、 內蒙古科學技術研究院等國內甜菜專家組成鑒定組， 對內蒙古農牧業科學院特色作物研究所選育出的甜菜單胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B 進行了田間育性和單胚性表型現場鑒定。

3.1.1 單胚雄性不育系 NM3005A 鑒定結果鑒定株數87 株，其中完全不育株86 株，半不育Ⅰ型1 株，完全雄性不育率為98.85%； 單胚株87 株， 單胚株率100%。

3.1.2 單胚雄性不育保持系 NM3005B 鑒定結果鑒定株數83 株， 其中不育株0 株， 可育株率為100%；單胚株83 株，單胚株率100%。

3.2 分子細胞質類型鑒定

利用F.V.Owen 型甜菜細胞質類型快速鑒定技術， 采用已開發的TR1 引物進行PCR 擴增，對NM3005A 及NM3005B 細胞質類型進行鑒定。

3.2.1 TR1 引物系列 TR1：

5'-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3'

5'-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3'

3.2.2 DNA 提取與檢測 在成系鑒定圃中分別隨機選取NM3005A 及NM3005B 植株各20 株，將甜菜生長期新鮮幼嫩葉片單株取樣裝入PE 管中，置入液氮罐帶回實驗室，利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取甜菜葉片DNA 并進行DNA 質量檢測。

3.2.3 PCR 反應體系及PCR 程序 甜菜細胞質基因型鑒定PCR 反應體系首先用ddH2O 將DNA 樣品稀釋到40～50 ng/μL，反應體系25 μL，其中DNA 模板1 μL、 上下游TR1 引物各1 μL、MIX 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 程序為94℃預變性5 min，95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min， 共30 個循環；72℃進一步延伸10 min，4℃+∞；4℃保存。 電泳檢測用PCR 產物5 μL， 使用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中電泳，電泳電壓120 V，電泳時長30 min。用凝膠成像系統紫外光下檢測電泳結果。

3.2.4 結果分析 PCR 電泳結果顯示， 單胚雄性不育系NM3005A 的細胞質類型為S 型， 單胚雄性不育保持系NM3005B 的細胞質類型為N2 型。 由圖1可知， 泳道M 為DL 100 Marker， 泳道1 ～10 為NM3005A，條帶位置在450 bp，細胞質類型為S 型；泳道11～20 為NM3005B，條帶位置在530 bp，細胞質類型為N2 型。

圖1 部分NM 3005A、NM 3005B 材料PCR 電脈檢測結果

3.3 電子顯微鏡花藥及花粉粒檢測鑒定

利用掃描電子顯微鏡對NM3005A 及NM3005B進行花藥及花粉粒檢測鑒定。

3.3.1 取樣和固定 選取NM3005A 及NM3005B 采種株開花前未開放的花蕾， 用生理鹽水清洗試樣表面， 將清洗后的試樣放入由0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖液配制的2%～3%戊二醛固定液中進行前固定，4℃下前固定2 h 以上。經戊二醛固定的生物試樣用與前固定相同的緩沖液充分漂洗后， 加入相同緩沖液配制的1%四氧化鋨固定液，4℃下固定1～2 h。

3.3.2 脫水和置換 采用濃度分別為50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進行梯度脫水， 每級濃度脫水5～15 min。 吸棄100%脫水劑，轉入醋酸異戊酯與脫水劑1∶1 的混合液中置換10～20 min， 并適當搖動，再轉入純醋酸異戊酯中充分置換。

3.3.3 干燥和粘樣 脫水后的生物試樣選用臨界點干燥法進行干燥。 粘樣采用導電雙面膠帶將試樣粘接在掃描電鏡樣品臺上，使試樣觀察面朝上。

3.3.4 表面導電處理 采用離子濺射法對干燥后的生物試樣表面噴鍍一層導電鍍層。

3.3.5 電鏡掃描 開啟掃描電鏡， 待真空度達到儀器規定的高真空指標后進行觀察前的儀器檢查，對中電子束，消除圖像的像散。 關閉電子槍發射后對樣品室放氣，按要求將試樣裝入樣品室，重新抽真空。根據生物試樣的觀察要求，設置掃描電鏡觀察條件。打開電子槍束流，選擇需要的信號檢測器，獲得二次電子掃描圖像或背散射電子掃描圖像。 根據觀察需要選擇合適的放大倍率，進行圖像聚焦、消像散、亮度和反差調節等操作。 對目標區域生物試樣形態結構進行圖像記錄。

3.3.6 電鏡掃描圖像結果 對不育系及其保持系的花藥、花粉的生物學特性進行比較觀察。 結果表明，甜菜單胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B的花藥和花粉在形態與細胞上存在明顯差異。 不育系NM3005A 花藥發育不正常， 形狀不規則且干癟；花粉粒為不規則類球形，表面粘稠且不光滑，花粉敗育。 保持系NM3005B 花藥發育正常，形狀規則且藥室飽滿；花粉粒為圓球形，表面光滑，萌發孔清晰可見（圖2～圖5）。

圖2 不育系花藥

圖3 不育系花粉

圖4 保持系花藥

圖5 保持系花粉

4 結語

雄性不育在植物中較為常見。 植物雄性不育表現特征為雌蕊發育正常而雄蕊敗育， 但雌蕊能夠接受外來花粉授粉從而達到授精目的[4]。 有研究表明，已經在140 多種植物中觀察到了植物雄性不育特征， 并且細胞質雄性不育的發生與線粒體基因組突變有著密切的關系[5-6]，如農作物水稻[7]、煙草[8]、玉米[9]等中都有雄性不育現象。 也正是因為雄性不育系的存在， 在很大程度上促進了雜種優勢在農作物中的應用，從而使得作物高產、穩產[10-11]。

甜菜的雄性不育系分為核不育型和質核互作型2 種。 核不育型是受一對隱性基因（aa）控制，而質核互作型其育性由細胞質基因S、N 和細胞核基因X、Z基因的相互作用決定的[12]，當細胞質為S 型，細胞核基因型為xxzz 時， 則為不育系； 細胞質為N 型細胞核為xxzz 時，則為保持系[13]。通過對Owen 型不育系（S 型）和正?？捎担∟ 型）線粒體的測序結果分析， 發現N 型具有S 型所沒有的4 個開放讀碼框（ORF）。 顯然，這4 個ORF 相關基因很可能與細胞質雄性不育相關， 所以推測CMS 是一種功能獲取而不是功能缺失的突變[14]。

甜菜質核互作基因型不育系是目前唯一用于世界范圍生產甜菜雜交種的雄性不育系[15]，作為生產一代雜種的理想親本品系， 其選育及應用研究一直是育種工作者研究的熱點。 甜菜雜種優勢利用關鍵在于選育甜菜不育系技術， 而選育不育系的關鍵在于選育甜菜保持系[16]。 雜交種具有較強的雜種優勢，因此甜菜雄性不育系及保持系的選育在現代甜菜育種中至關重要，能為解決甜菜種子“卡脖子”問題、打好種業翻身仗奠定堅實基礎。