3種佐劑對豬瘟病毒E2蛋白免疫效果的影響

陳玉梅,劉運超,祁艷華,梁 超,周景明,王愛萍*

(1.鄭州大學生命科學學院,河南鄭州 450001;2.河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室,河南鄭州 450001)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性傳染病[1-2]。近年控制豬瘟應用最廣泛的是減毒活疫苗[3],經典的CSFV疫苗,如C-strain、GPE-strain、LPC-strain和LK-VNIVViM strain,雖然不具有區分感染和接種疫苗動物的能力,但提供了對CSFV感染的強大保護。FlagT4Gv、TWEJ2、FLC-LOM-Berns等標記疫苗接種家豬后可控制CSF的傳播并降低急性死亡率,但疫苗的廣泛使用也導致了豬瘟的復雜性,如臨床癥狀從典型轉向非典型,免疫抑制和持續感染的現象普遍存在,這也給控制CSF帶來了困難[4]。

囊膜糖蛋白E2是CSFV病毒顆粒的主要成分,有多種功能,如病毒對細胞的吸附、保護性免疫反應的激發和病毒毒力[5]。研究顯示,強毒CSFV的Erns(E0)、E1或E2糖蛋白的糖基化降低了對豬的病毒毒性[1]。而糖蛋白E2和E0是感染動物中激發抗豬瘟抗體的主要靶點,因此基于E2和E0靶點的疫苗研究很多,用桿狀病毒系統表達糖蛋白E2和E0,并測試了它們在兔體內的保護性免疫,發現E2蛋白誘導的特異性抗體、中和抗體和細胞免疫應答水平較高,而僅接種E0不能誘導保護性免疫反應[6]。通過腺病毒載體表達E0和E2基因,構建了重組腺病毒E0-E2(rAd-E0-E2)疫苗,并確定了最小免疫劑量和免疫持續時間[7]。制備E2-CD154亞單位候選疫苗,其在懷孕母豬中是安全有效的,并且在出生后第63天,傳遞給后代的被動免疫仍然具有保護性[8]。用于CSFV E2純化的肽配體進行分子對接,從轉基因水稻種子中表達純化E2蛋白,對小鼠免疫抗體的評估表明,接種后第42天抗體阻斷率達到86.18%和90.68%[9],而通常情況下阻斷率Blocking%≥50%的樣本可認定為產生保護。

體外表達的CSFV E2蛋白可以刺激機體的保護性免疫應答,產生高滴度的特異性抗體和中和抗體,有效抑制病毒感染[10]。但由于CSFV E2蛋白亞單位疫苗只有一種免疫原,與全病毒相比,其T細胞免疫應答水平較弱,產生的保護性抗體滯后,限制了其推廣應用。佐劑是一種非特異性免疫增強劑,其本身不能讓機體產生免疫應答,但其用在疫苗中便能激發強烈的體液、細胞免疫,可以誘發機體針對特定抗原產生更高效、更長期的免疫應答。獸用疫苗常用的佐劑有無機佐劑、有機佐劑、合成佐劑以及油佐劑等[11]。其中氫氧化鋁(明膠)為常用的無機佐劑,明膠吸附的抗原呈顆粒狀,可增強抗原呈遞細胞(Antigen-presenting cells,APC)對抗原的攝取,氫氧化鋁佐劑主要誘導血清抗體反應;50V佐劑劑型為油包水(W/O)乳化液,主要是植物來源的甘露醇和油酸高度精煉制成,在豬體內W/O乳劑主要功能是促進抗體產生、淋巴細胞增殖和臨床保護;MontanideTM ISA 201 VG(201佐劑)為雙相佐劑,水包油包水(W/O/W)劑型[12],主要成分為礦物油,抗原被包裹在內部水滴和外部水相中,外水相中的抗原容易被免疫系統利用,而內部水滴中的抗原則緩慢釋放。

本文研究鋁佐劑、50V佐劑和201佐劑分別與CSFV E2蛋白聯合制備亞單位疫苗免疫Balb/c小鼠,評價不同佐劑對CSFV E2蛋白刺激機體T/B細胞免疫反應,篩選出高效的免疫佐劑,為提高CSFV亞單位疫苗的免疫效果,揭示不同佐劑類型對CSFV E2蛋白亞單位疫苗免疫在小鼠體內誘發免疫反應的差異,為CSFV E2蛋白亞單位疫苗的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體與菌種 pFast Bac I、pFast Bac I- gp67-E2、NL-E2等質粒和菌種均為鄭州大學分子免疫學實驗室保存。

1.1.2 細胞系和病毒株 Sf 21細胞、PK-15細胞有鄭州大學分子免疫學實驗室培養并保存;CSFV石門強毒株、CSFV疫苗毒株等均由鄭州大學分子免疫學實驗室增殖及保存。

1.1.3 實驗動物 4～6周齡雌性Balb/c小鼠,購自河南省鄭州市實驗動物中心。

1.1.4 主要試劑BamHⅠ和XhoⅠ內切酶,NEB公司產品;RPMI 1640培養基、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ ELISA KIT及Hematoxylin-Eosin/HE Staining Kit,北京索萊寶科技有限公司產品;Sf 900TMⅡ SFM昆蟲細胞無血清培養基(10902104)、CellfectinTMⅡ Reagent轉染試劑(10362100),賽默飛世爾科技公司產品;佐劑MONTANIDETMISA 50 V2,法國賽比克(Seppic)公司產品;Anti-6×His-tag antibody,Proteintech;HRP-G@M-IgG,Abcam公司產品;DH10Bac感受態細胞(BC112-01)、Trans5α感受態細胞(CD201-01),北京全式金生物技術有限公司產品;胰酶、胎牛血清(FBS),Gibco公司產品;Ni-NTA親和層析填料,Norvagen公司產品;其他常規試劑均為分析純。

1.1.5 主要儀器 酶標儀(iMark)、洗板機(1575)和凝膠成像系統 ,美國伯樂公司產品;多功能酶標儀,美國MD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 CSFV E2蛋白的純化及鑒定 以pFast Bac I-gp67-E2重組質粒轉染DH10Bac感受態細胞制備粘粒NL-E2,以粘粒NL-E2轉染Sf 21細胞分別制備P1代、P2代和P3代感染病毒;以P3代陽性感染病毒為毒種擴大培養,表達CSFV E2重組蛋白,采用Ni2+柱親和層析咪唑梯度洗脫純化制備重組E2蛋白,用SDS-PAGE及Western blot進行鑒定。

1.2.2 佐劑配伍及免疫程序 將純化獲得的重組E2蛋白分別與鋁佐劑、50V佐劑和201佐劑配伍制備亞單位疫苗,具體配伍方式見表1。分別選取30只健康的Balb/c小鼠隨機分成6組,每組5只(表1),背部皮下多點注射;首免后21 d加強免疫1次。免疫后0、14、21、28、35 d斷尾采血收集血清。

表1 每劑疫苗抗原含量

1.2.3 間接ELISA測定抗體效價及抗體消長規律 用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L、pH9.6,CBS)將E2蛋白稀釋成2 μg/mL,按100 μL/孔加入96孔酶標板內,4℃包被過夜;用磷酸鹽吐溫緩沖液(Phosphate buffered saline tween-20,PBST)洗板3次,加入5%脫脂奶粉37℃封閉2 h;棄去封閉液,PBST洗板2次,甩干,一抗用待檢小鼠血清,按2倍倍比稀釋,即1∶100、1∶200……1∶102 400,每孔加入50 μL稀釋后血清,同時,設1∶500稀釋的小鼠陽性血清為陽性對照,37℃ 反應1 h;二抗使用1∶5 000稀釋的HRP-標記的羊抗鼠IgG,37℃ 反應30 min,TMB顯色液顯色,測定抗體效價。

1.2.4 阻斷ELISA檢測 采用IDEXX豬瘟抗體檢測試劑盒,對小鼠血清進行檢測(將小鼠血清稀釋20倍用于檢測),具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.5 淋巴細胞分離增殖和細胞因子測定 免疫后第35天采集抗凝血,處死小鼠分離脾臟,用索萊寶的淋巴細胞分離試劑盒分離淋巴細胞,然后使用CCK-8進行淋巴細胞增殖實驗,同時使用索萊寶中的小鼠IL2、IL4、IL10、IFN-γ ELISA KIT對免疫后35 d小鼠血清進行檢測,分析IL2、IL4、IL10和IFN-γ的表達情況。

2 結果

2.1 CSFV E2蛋白的純化與鑒定

以桿狀病毒表達系統重組表達CSFV E2蛋白,用親和層析純化制備重組E2蛋白,經SDS-PAGE及Western blot鑒定獲得的重組E2蛋白純度大于95%,糖基化的E2蛋白分子質量為48～62 ku,可以與豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體發生特異性反應(圖1),為進一步進行免疫效果評價奠定基礎。

M.蛋白分子質量標準;1.SDS-PAGE鑒定;2.Western blot鑒定

2.2 特異性抗體效價測定

用間接ELISA檢測小鼠抗體應答情況,發現在首免后3周(即免疫后第21天)和二免后2周(即免疫后第35天),A組鋁佐劑組抗體效價分別為1∶1 600和1∶51 200,B組50V佐劑組抗體效價分別為1∶12 800和1∶204 800,C組201佐劑組抗體效價分別為1∶6 400和1∶102 400,D組陽性對照組抗體效價分別為1∶6 400和1∶102 400,E組無佐劑組E2蛋白免疫后抗體效價分別為1∶1 600和1∶3 200,F組PBS陰性對照組無特異性抗體產生(圖2)。

A.一免后21 d血清的抗體效價;B.一免后35 d血清的抗體效價

2.3 抗體消長規律測定

測定免疫后0、14、21、28、35 d的抗體消長規律,結果顯示,在免疫后第14天各疫苗免疫組特異性抗體已經產生,并隨時間推移而升高,在第21天(二免以后1周)至28 d抗體水平進一步升高直至第35天,特異性抗體有一個明顯的提升,且有佐劑的A、B、C、D組明顯高于無佐劑的E組,F組PBS陰性對照組無特異性抗體產生(圖3)。

A.抗體消長規律檢測;B.免疫后14、21、28、35 d抗體效價測定

2.4 抗體阻斷率的檢測

測定免疫后14、21、28、35 d的抗體阻斷率,結果在免疫后第21天,B、C和D組抗體阻斷率大于50%,在免疫后第28天A組抗體阻斷率大于50%,而無佐劑的E組抗體阻斷率則明顯低于A、B、C和D組,F組PBS陰性對照組無阻斷抗體產生(圖4)。

圖4 血清抗體阻斷率檢測

2.5 不同佐劑對E2蛋白刺激機體T細胞的免疫應答

淋巴細胞經ConA或滅活豬瘟病毒刺激后,用CCK-8試劑盒檢測淋巴細胞增殖活性,經ConA或滅活豬瘟病毒刺激,與PBS對照組相比,淋巴細胞活性均無顯著差異(圖5)。分別用ELISA檢測免疫血清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等的表達變化,發現IL-2表達量在10.52～28.46 pg/mL,各免疫組與陰性對照組相比沒有顯著差異(圖6);IL-4表達量在498.4～892.23 pg/mL,與F組相比,A、B、C組差異顯著,其中B組50V佐劑組表達量最高為892.23 pg/mL,D、 E組差異不顯著(圖6);IL-10表達量在31.20～59.46 pg/mL,各免疫組與陰性對照組相比差異均不顯著(圖5);IFN-γ表達量在44.13～56.47 pg/mL,各免疫組與陰性對照組相比均沒有顯著差異(圖6)。

圖5 免疫后35 d淋巴細胞增殖活性檢測

圖6 免疫血清細胞因子檢測

3 討論

囊膜糖蛋白E2是感染動物中激發抗豬瘟抗體的主要靶點,基于CSFV E2蛋白的疫苗研究較多,有利用畢赤酵母表達系統表達E2蛋白[13]、利用桿狀病毒表達系統表達E2蛋白[6,14],有在中國倉鼠CHO-dhfr-細胞中表達的[15],還有利用水稻、煙草等植物表達系統生產E2蛋白,接種植物源E2蛋白疫苗的豬顯示出有效的中和抗體和免疫保護[10,16-17]。相關研究都證實E2蛋白作為亞單位疫苗靶點的有效性,本研究用桿狀病毒表達系統表達經Ni-NAT親和層析純化獲得CSFV E2蛋白,經硫酸銨沉淀和Ni-NTA親和層析純化獲得純度約95%的E2蛋白;通過選擇鋁佐劑、50V佐劑、201佐劑分別與重組E2蛋白組合制備亞單位疫苗,圍繞不同佐劑對豬瘟亞單位疫苗免疫效果的影響開展研究,檢測免疫后小鼠血清特異性抗體水平及免疫細胞相關因子水平,發現有佐劑組A、B、C、D組的特異性抗體水平明顯優于無佐劑組(E組);50V佐劑(B組)和商品疫苗對照組(D組)亞單位疫苗的特異性抗體水平明顯優于201佐劑(C組)和鋁佐劑(A組);通常情況下IFN-γ、IL-2表示Th1免疫應答,以IL-4、IL-10表示Th2免疫應答,本研究通過比較細胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平發現,除了IL-4外,IL-2、IL-10和IFN-γ在各組的含量差異并不顯著;而50V佐劑、商品苗和201佐劑亞單位疫苗IL-4的分泌量明顯優于其他各組,其中50V佐劑IL-4含量最高,幾乎是PBS免疫組的2倍。IL-4是Th2細胞分泌的細胞因子,它也在調節體液免疫和適應性免疫中起關鍵作用,說明50V佐劑和201佐劑激發的免疫反應以Th2免疫應答為主。

本研究中油包水(W/O)的50V佐劑對E2蛋白的免疫效果提升明顯優于其他佐劑,50V佐劑(W/O)組抗體效價是201佐劑(W/O/W)組的2倍,是氫氧化鋁無機佐劑組的4倍,在免疫后第21天阻斷率已達到60%,明顯優于氫氧化鋁無機佐劑組40%和ISA201 55%的阻斷率,50V佐劑能明顯提高CSFV E2蛋白亞單位疫苗的免疫效果。有研究用水佐劑(GEL01)、雙相佐劑(ISA201)以及油包水佐劑(ISA植物油)3種佐劑對豬瘟E2基因工程亞單位疫苗免疫效果進行比較研究,發現油包水佐劑(ISA植物油)制備的疫苗與另外2種佐劑制備的疫苗相比,免疫空窗期短,免疫持續期長,中和抗體水平高,在臨床上更具優勢[18],這一結果與本研究結果基本一致。揭示了不同佐劑類型對CSFV E2蛋白亞單位疫苗免疫在小鼠體內誘發免疫反應的差異,為CSFV E2蛋白亞單位疫苗的研制提供理論依據和技術支撐。