林麝源蠟樣芽孢桿菌分離鑒定及致病性試驗

呂 妮,李 穎,李 蔚,胡清霞,陳雪梅,張琰杰,馬永華,王玉龍,王興龍*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100;2.銅川市王益區疫病預防控制中心,陜西銅川 727000;3.漢中職業技術學院,陜西漢中 723000)

林麝(Moschusberezovskii)又名香獐,其雄麝香腺囊分泌的麝香是中醫藥的名貴藥材,亦是一種高級香料,具有極高的藥用價值和經濟價值[1]。林麝主要棲息于針闊混交林中,也適于在針葉林的環境生活,棲息高度可達2 000～3 800 m,但低海拔環境也能生存,在我國主要分布于北抵寧夏六盤山、陜西秦嶺山脈,東至安徽大別山、湖南西部,西至四川、西藏波密、察隅、云南北部,南至貴州、廣東及廣西北部山區[2]。為有效保護林麝,國家近年來支持鼓勵人工養殖林麝,但由于各養殖單位缺乏技術與種源交流,缺少龍頭企業和相關科研機構示范引導和技術研究等,人工養殖林麝死亡率居高不下[3]。林麝的易發疾病有10類53種[4],呼吸道類疾病最多。本文收集死亡時間不超過24 h的林麝進行剖檢,采集死亡林麝的淋巴結、肺臟、肝臟等病變組織,通過細菌分離鑒定、生化試驗和藥物敏感性試驗對分離菌進行了特征分析,并為該病的有效防治提供理論依據。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和樣品來源 昆明小鼠15只,體重30～40 g,20日齡左右,購自西安交通大學醫學院。陜西省某林麝養殖基地死亡24 h內的1只3歲左右的林麝,無菌采取其淋巴結、肺臟、肝臟等病變組織,低溫保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 普通營養培養基、LB營養培養基、綿羊血瓊脂培養基、DNA Marker DL 2 000 Plus、2×Taq MasterMix均為南京諾唯贊生物科技有限公司產品;細菌微量生化鑒定管,杭州濱和微生物試劑有限公司產品;細菌DNA提取試劑盒(離心柱型),天根生化科技有限公司產品;恒溫搖床(THZ-300)和恒溫培養箱(DRP-9162),上海森信有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 觀察臨床癥狀及剖檢 觀察記錄該基地發病林麝的臨床癥狀,對發病死亡的林麝進行解剖,檢查內臟病變,采集病料并進行記錄。

1.2.2 細菌分離鑒定 無菌采取淋巴結、肺臟及肝臟病變組織的切面,分別涂布于普通瓊脂培養基和5%綿羊血瓊脂培養基上,37℃恒溫培養24～36 h,觀察有無細菌生長。若有細菌生長,則用無菌接種環挑取形態一致的菌,采用三段劃線法分別接種于普通營養瓊脂培養基和5%綿羊血瓊脂培養基,置于37℃恒溫箱中純化培養12～16 h。優勢菌進行細菌純化后,對細菌進行菌落形態的觀察和革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化試驗 將分離純化菌接種在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甲基紅、過氧化氫酶、乙酰甲基甲醇、尿素、甘露醇、木糖、吲哚、乳糖和硫化氫等12種微量生化鑒定管,37℃恒溫箱培養24～48 h,記錄結果并參考《伯杰細菌鑒定手冊》第8版進行判斷。

1.2.4 16S rRNA基因測序及遺傳進化分析 以分離菌株的DNA為模板,16S rRNA PCR通用引物LPW-57(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和LPW-58(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)為上下引物,20 μL反應體系進行PCR擴增,PCR擴增程序:94℃ 2 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個循環;72℃ 5 min。用PCR產物進行核酸凝膠電泳,比對目的條帶大小后將PCR產物送到西安擎科生物有限公司進行測序。將測序結果與NCBI數據庫中已有的序列進行Blast比對,并選取數據庫中部分菌株序列與分離菌株基因序列進行系統遺傳進化分析,用MEGA7.0軟件構建進化樹。

1.2.5 藥敏試驗 分離菌的藥敏試驗用紙片法進行。用生理鹽水將菌液矯正至0.5麥氏比濁管濃度,均勻涂布于普通營養瓊脂平板上,用無菌鑷子貼上藥敏片,置37℃恒溫箱培養18 h后,測量抑菌圈的直徑,抑菌環直徑判定依據歐盟藥物敏感性試驗標準(EUCAST)。

1.2.6 小鼠致病性試驗 挑取純培養的單菌落溶于無菌PBS中制成菌懸液。將20日齡健康小鼠隨機分成3組,每組5只:陰性對照組、1×108CFU/mL劑量組和1×109CFU/mL劑量組。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水,0.25 mL/只;試驗組小鼠分別腹腔注射108和109CFU/mL的菌液,0.25 mL/只;觀察小鼠發病情況。

2 結果

2.1 臨床癥狀及病理變化

林麝發病初期體溫升高,部分體溫可達41℃,隨后出現精神沉郁、食欲廢絕、呼吸急促等癥狀;個別林麝出現跛行、頭頸扭曲等神經癥狀。剖檢可見死亡林麝淋巴結、咽部以及膽囊腫大;肝臟邊緣鈍厚有出血點,且與胸腔產生粘連;肺臟腫大,廣泛性出血(圖1)。

圖1 樣品臨床癥狀及肺臟病變

2.2 細菌分離鑒定

將分離的優勢菌在37℃恒溫箱培養12～16 h后,該菌在普通營養瓊脂上形成白色、圓形、凸起、直徑約1～3 mm、呈白蠟狀的菌落;在血瓊脂平板上形成淺灰色、圓形、凸起、似毛玻璃狀的菌落。革蘭氏染色鏡檢,該菌為革蘭氏陽性桿菌,呈單個或長鏈狀排列(圖2)。

A.普通營養瓊脂平板生長形態;B.血平板生長形態;C.革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.3 生化試驗

生化鑒定結果顯示,該菌可分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甲基紅、過氧化氫酶、乙酰甲基甲醇等,但是不分解尿素、甘露醇、木糖、吲哚、乳糖、硫化氫等(表1)。與《伯杰細菌鑒定手冊》第8版比對,該分離菌株為疑似蠟樣芽孢桿菌。

表1 生化鑒定結果

2.4 16S rRNA基因測序結果及系統進化樹

對分離菌株進行16S rRNA PCR擴增,PCR擴增產物大小約為1 300 bp(圖3),與預期片段大小一致。將測序結果與NCBI數據庫中已有的序列進行Blast比對分析,該菌與模式菌株Bacilluscereus同源性為99%,結合菌株的生化特性和形態,鑒定該菌為蠟樣芽孢桿菌,命名為LN-20221212。通過Mega 7.0軟件對該菌株構建系統發育進化樹(圖4),該菌株和與其他分離菌株的同源性較遠。

M.DNA標準DL 2 000; 1.分離菌株; 2.鴨源蠟樣芽孢桿菌; 3.牛源蠟樣芽孢桿菌; 4.陰性對照

圖4 基于16S rRNA構建的系統發育樹

2.5 藥敏試驗

蠟樣芽孢桿菌對哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢他啶、丁胺卡那、慶大霉素和環丙沙星敏感,對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、多黏菌素B和復方新諾明耐藥(表2)。

表2 分離菌的藥物敏感性試驗結果

2.6 小鼠致病性試驗

注射109CFU/mL的試驗小鼠4 h后出現精神沉郁、食欲不振的癥狀,12 h后試驗組小鼠開始出現昏迷死亡現象,24 h內攻毒小鼠全部死亡;注射108CFU/mL的試驗小鼠6 h后出現精神沉郁和食欲不振的癥狀,12 h后部分小鼠出現昏迷死亡現象,48 h后攻毒小鼠全部死亡。解剖死亡小鼠發現肺臟腫大并出血;肝臟質地變脆、顏色變灰,對照組小鼠無明顯異常。試驗組死亡小鼠肺臟、肝臟進行細菌分離培養,革蘭氏染色后鏡檢,得到典型的革蘭氏陽性芽孢桿菌,而對照組小鼠肺臟、肝臟細菌分離培養,染色檢查未見該菌,表明了蠟樣芽孢桿菌對小鼠具有較強的致病性。

3 討論

蠟樣芽孢桿菌可引起人食物中毒和嚴重的非腸道感染[5]。該菌兩端平整,呈短鏈排列,無莢膜,有的菌株具有周鞭毛,屬于兼性厭氧菌,最適生長溫度為30～32℃,可生長pH為4.9～9.3,營養要求比較低。蠟樣芽孢桿菌的致病性與組織破壞性/反應性胞外酶的產生密切相關[6]。在這些分泌性毒素中,有四種溶血素[7],3種不同的磷脂酶,1種嘔吐誘導毒素,以及3種成孔腸毒素,即溶血素BL(HBL)、非溶血性腸毒素(NHE)和細胞毒素K[8]。近年來,蠟樣芽孢桿菌感染動物的情況逐漸增多[9],許多地方報道了與蠟樣芽孢桿菌密切相關的仔豬腹瀉、奶牛子宮內膜炎、馬皮膚膿腫結節、哺乳仔豬死亡、牛猝死等病例,分離的蠟樣芽孢桿菌對小鼠有不同程度的致死性[10]。

本文所用蠟樣芽孢桿菌來源于陜西省某林麝養殖場猝死林麝的淋巴結、肝臟和肺臟等病理組織。該菌對青霉素、苯唑西林、氨芐西林等獸醫臨床常用抗生素表現出較高的耐藥性,而慶大霉素、四環素與氟苯尼考等對該菌抑制作用明顯。分離菌株對健康小鼠有明顯的致病性,試驗組小鼠在接種菌液后出現精神沉郁、食欲減退、顫抖甚至死亡。無菌分離采集死亡小鼠的病變組織,涂片染色后鏡檢,得到典型的革蘭氏陽性芽孢桿菌。試驗結果表明該菌具有致病性,為林麝相關疾病的治療和防控提供了參考。