基于N和G蛋白的HeV抗體間接ELISA檢測方法的建立

朱盈名,王迎平,馮旭東,朱桓奕,楊曉偉,陳 翔,王 艷,趙光偉*

(1.西南大學動物醫學院,重慶 402460;2.上海海關,上海 200135;3.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135)

亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)是副黏病毒科亨尼帕病毒屬的一種烈性人獸共患病病原,其培養需在生物安全等級為4級的實驗室中進行[1]。該病毒1994年在澳大利亞患有嚴重發熱性呼吸道疾病的馬場中被報道,發病馬表現發熱、精神沉郁、進食減少、心動過速、呼吸困難、面部水腫和共濟失調等癥狀,約75%的病例48～72 h內死亡[2]。此后20年在澳大利亞沿海地區共有58起HeV感染事件,呈散發態勢[3]。目前我國尚未有HeV感染的報道,然而由于國際貿易、馬術比賽以及賽馬產業的蓬勃發展,馬匹出入境頻繁,存在境外輸入的風險,因此HeV是我國海關、口岸、出入境等機構必檢的病原之一。

HeV為單股負鏈RNA病毒,編碼6種結構蛋白,其中G蛋白為HeV的囊膜糖蛋白,通過Ephrin B2/3受體結合宿主細胞附著蛋白感染細胞[4],是感染中重要的錨定蛋白,目前國外已有基于G蛋白的商品化馬疫苗投入臨床,但接種率偏低,如澳大利亞馬群接種率僅為11%～17%[5];N蛋白為HeV的核衣殼蛋白,為主要抗原表位區域,可刺激機體產生中和抗體,是開發診斷試劑的優選靶點,目前已有利用該蛋白做早期診斷研究的報道[6]。針對該病毒的檢驗檢疫國際通用的方法是采用RT-PCR或RT-qPCR技術檢測病毒核酸,我國口岸部門亦是如此,然而這種方法對動物的某些隱性感染以及疫苗接種史等均不能做出有效判斷,基于此,本試驗構建HeV重組N、G蛋白,建立間接ELISA(iELISA)診斷方法,為海關、出入境等技術部門作為HeV臨床血清學診斷提供技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清和馬匹 馬陰性血清(n=250)和陽性對照血清(非洲馬瘟病毒、西尼羅病毒、馬梨形蟲、馬傳染性貧血病毒、馬媾疫錐蟲、馬鼻疽桿菌)均由上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心提供。1歲健康雌馬4匹,飼喂于上海踏雪無痕馬術俱樂部有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 pET30a Easy Vector,普洛麥格(北京)生物技術有限公司產品;NdeⅠ、Hind Ⅲ限制性內切酶,北京全式金生物技術有限公司產品;2×RapidTaqMaster Mix和DL 2 000 DNA Marker,南京諾唯贊生物科技有限公司產品;Ni-NTA 6FF His標簽蛋白純化試劑盒,上海七海生物醫藥科技有限公司產品;山羊抗馬IgG-HRP,武漢三鷹生物技術有限公司產品;弗氏佐劑,上海碧云天生物技術有限公司產品;引物、核酸合成及測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成;酶標儀(Infinite?200 PRO),瑞士TECAN公司產品。

1.2 方法

1.2.1 密碼子優化及合成 為提高基因的表達概率,使適應宿主工程菌大腸埃希氏菌BL21(DE3)的表達偏好,用Jcat網站(http://www.jcat.de/)對HeV的N和G目的基因(Gene ID:1446470、1446471)進行優化,改變低概率峰密碼子。便于后續原核表達載體的構建,在序列的兩端分別添加NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位點序列,并在5′端加入一個啟動子和His標簽序列以便于后續蛋白的純化,在3′端加上終止密碼子,策略如下:NdeⅠ(CATATG)-啟動子(ATG)-His標簽(CATCATCATCACCACCAC)-N蛋白或G蛋白基因(HeV)-終止密碼子(TAATGA)-Hind Ⅲ(AAGCTT)。設計好的序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 重組質粒的構建 將人工合成N、G序列和pET30a原核表達載體分別用限制性內切酶Hind Ⅲ和NdeⅠ進行酶切反應,膠回收試劑盒回收其消化后的片段,繼而利用T4連接酶進行兩個黏末端片段的連接,酶切和連接的反應體系如下:酶切反應體系(20 μL):PET30a質?；騈基因或G基因5 μL,NdeⅠ 1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,緩沖液2 μL,雙蒸水11 μL;連接反應體系(20 μL):PET30a質粒2 μL,N或G基因5 μL,T4連接酶1 μL,T4連接酶緩沖液2 μL,雙蒸水10 μL。構建的重組質粒經Hind Ⅲ、NdeⅠ雙酶切鑒定和測序鑒定后備用。

1.2.3 重組質粒的原核表達 測序正確的陽性質粒按0.5 μL/100 μL 轉入BL21(DE3)感受態細胞,用50 μg/mL硫酸卡那霉素作為篩選抗生素。挑取陽性克隆,接種于50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中,37℃培養至OD 600 nm值=0.6,加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),37℃、220 r/min誘導4 h。誘導完成后將菌液轉移至滅菌后的50 mL離心管中,4℃、10 000 r/min離心10 min,棄上清收集菌體沉淀,加入少量滅菌生理鹽水洗滌菌體,4℃、10 000 r/min離心10 min,棄上清收集沉淀,加入lysis buffer(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,5%甘油,0.5 mmol/L PMSF,5 mmol/L 咪唑,pH7.4)室溫反應30 min,冰浴,超聲破碎菌體(150 W,工作4 s,停3 s,14 min)。破碎后液體4℃、10 000 r/min離心10 min,分別收集上清與沉淀,上清保存于-80℃待用,沉淀用洗滌液1(100 mmol/L Tris-HCl,2 mol/L 尿素,10 mL/L吐溫-20,pH 7.4)洗滌,室溫反應8 min,4℃、10 000 r/min離心10 min。收集沉淀用洗滌液2(50 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L尿素,pH 8.0)洗滌1次,4℃、10 000 r/min離心10 min,沉淀用滅菌生理鹽水洗滌,4℃、10 000 r/min離心10 min。收集沉淀為包涵體,用變性液(8 mol/L尿素)溶解包涵體,4℃ 10 h。變性后蛋白液裝入透析袋,用100×體積的6 mol/L尿素、4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、1×PBS溶液(pH7.4)在4℃分別透析復性4 h。吸出蛋白液,利用SDS-PAGE和Western blot檢測蛋白表達情況,將表達的粗蛋白通過鎳離子親和層析純化,純化重組蛋白置-80℃保存待用。

1.2.4 HeV-N、HeV-G多克隆抗體的制備 將在-80℃保存的純化HeV-N、HeV-G蛋白置冰水中融化,按照1∶1的比例與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑充分乳化,接種馬亨德拉病毒陰性雌馬。首次免疫時,將弗氏完全佐劑乳化蛋白各100 μg接種于馬頸部皮下,初次免疫后14 d與28 d再注射等量弗氏不完全佐劑乳化蛋白。陰性對照組馬注射等量生理鹽水。每次免疫14 d后采血1～2 mL,分離血清置-20℃保存。

1.2.5 iELISA檢測方法的建立 矩陣法檢測HeV-N、HeV-G蛋白最佳包被濃度以及一抗的稀釋倍數。在碳酸鹽包被液中將純化HeV-N、HeV-G蛋白稀釋成1、2、4、6、8、10 μg/mL,每濃度鋪8個酶標孔,100 μL/孔。4℃過夜包被。次日棄去孔內液體拍干,用洗滌液清洗酶標孔(每次洗滌液停留1 min,拍干,重復3次),5%脫脂奶粉200 μL/孔,37℃孵育2 h,洗滌酶標孔同上操作。以陰性馬血清和免疫后馬血清作為陰、陽性對照,TBS為空白對照,用TBS將血清按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000的比例稀釋。100 μL/孔加入稀釋后的血清(1∶50～1∶1 000),37℃孵育1 h。洗滌后加入1∶4 000比例稀釋的山羊抗馬IgG-HRP偶聯物100 μL/孔,37℃孵育1 h。洗滌后100 μL/孔加入TMB顯色液,37℃顯色10 min。加入50 μL/孔ELISA終止液,使用熒光多功能酶標儀讀取OD 450 nm值;以P/N值最大為評判標準。

1.2.6 iELISA檢測方法陰、陽性臨界值的計算 檢測250份馬陰性血清OD 450 nm值,計算平均值和標準差σ,以置信區間99%“平均值+3σ”為臨界值,OD 450 nm值大于或等于臨界值判定為陽性,小于臨界值判定為陰性。

1.2.7 iELISA檢測方法條件的優化 比較不同條件下iELISA檢測方法的包被條件(37℃ 1、2、3 h和4℃過夜)、封閉條件(5%脫脂奶粉、2% BSA、1%明膠、5%豬血清各0.5、1、1.5、2 h)、一抗孵育時間(30、45、60、80 min)、二抗稀釋度與孵育時間(1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000各30、45、60、80 min)、顯色時間(10、20、30 min)。以P/N值最大為評判標準,確定最佳反應條件。

1.2.8 iELISA方法靈敏度、特異性、重復性的測定 根據已優化iELISA檢測方法,用1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀釋的陽性對照確定iELISA方法的靈敏度,并利用Western blot對其進行驗證。用馬陽性血清與其他馬屬動物相關病原陽性血清(非洲馬瘟病毒、西尼羅病毒、馬梨形蟲、馬傳染性貧血病毒、馬媾疫錐蟲、馬鼻疽桿菌)確定iELISA方法的特異性。用5批不同時間包被的酶標板板與同批次酶標板檢測5份血清,計算變異系數(CV)確定iELISA方法的重復性,以CV小于10%為評價標準。

1.2.9 iELISA方法準確性的測定 利用3份陽性血清與250份陰性血清對所建立的ELISA檢測方法進行準確性評估,以其敏感性為縱坐標,(1-特異性)為橫坐標,繪制ROC(receiver operating characteristic curve)曲線圖,分析檢驗該方法的準確性。

2 結果

2.1 重組蛋白表達載體的構建

設計的HeV-pET30a(+)-N與HeV-pET30a(+)-G質粒經密碼子優化,序列的CG含量分別從原來的57.13%和53.70%,下降到51.22%和50.60%,CAI值從原來的0.64和0.65均提高到1.0,表達概率提高。酶切鑒定結果(圖1)顯示N和G基因均成功連接到pET30a(+)載體,測序結果證實所構建的重組表達載體正確。

A:1.重組質粒N; 2.重組質粒N雙酶切產物;B:1.重組質粒G,2.重組質粒G雙酶切產物,M.DNA標準DL 10 000

2.2 重組蛋白的表達

陽性菌株經IPTG誘導,經SDS-PAGE檢測(圖2),發現N和G重組蛋白均成功表達;蛋白經變性、復性,用Western blot進行驗證(圖3),證實確為目的蛋白。

M.蛋白分子質量標準;1～6.未誘導BL21(DE3)全菌、誘導pET30a空載體、HeV-N表達蛋白、純化的HeV-N蛋白、HeV-G表達蛋白、純化的HeV-G蛋白

A.HeV-N鑒定結果;1～4.未誘導BL21(DE3)全菌、誘導pET30a空載體、重組N蛋白、純化N蛋白;B.HeV-G鑒定結果;1～4.未誘導BL21(DE3)全菌、誘導pET30a空載體、重組G蛋白、純化G蛋白,M.蛋白分子質量標準 A.Identification result of recombinant HeV-N protein,1-4.Control without chemically induced expression in BL21 (DE3),control of empty vector (pET30a),recombinant HeV-N protein,purified HeV-N protein,respectively;B.Identification result of recombinant HeV-G protein,1-4.Control without chemically induced expression in BL21 (DE3),control of empty vector (pET30a),recombinant HeV-G protein,purified HeV-G protein,respectively,M.Protein molecular weight Marker

2.3 iELISA檢測方法的建立

用方陣法確定iELISA方法中HeV-N、HeV-G蛋白的包被濃度分別為10 μg/mL和8 μg/mL,被檢馬血清的稀釋倍數為1∶800。

2.4 iELISA檢測方法陰、陽性臨界值的計算

在正交試驗結果基礎上對250份馬陰性血清樣品進行檢測,結果進行統計學分析(圖4),HeV-N蛋白檢測結果平均值0.1470,標準方差0.029,即陰、陽性臨界值為0.235;HeV-G蛋白檢測結果平均值0.1610標準方差0.035,即陰、陽性臨界值為0.267。

圖4 iELISA方法臨界值的確定

2.5 iELISA檢測方法條件的優化

對iELISA檢測反應條件進行優化,確定最佳反應條件(圖5)。HeV-N蛋白最佳包被條件為4℃過夜,5%脫脂奶粉37℃封閉2 h,血清最佳作用時間30 min,二抗最佳孵育條件為1∶8 000稀釋37℃作用60 min,37℃顯色10 min;HeV-G蛋白最佳包被條件為4℃過夜,2% BSA 37℃封閉2 h,血清最佳作用時間80 min,二抗最佳孵育條件為1∶8 000稀釋37℃作用80 min,37℃顯色10 min。

A.包被時間;B.封閉時間;C.血清反應時間;D.二抗稀釋倍數及時間;E.顯色時間

A.間接ELISA方法的敏感性試驗結果;B.Western blot方法驗證結果,1～9.分別為陽性對照稀釋度1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600

2.6 iELISA方法靈敏度、特異性和重復性的檢測

對HeV-N和HeV-G兩種蛋白所確立的iELISA方法進行敏感性檢測,陽性血清進行1∶100～1∶125 600倍比稀釋,結果顯示HeV-N蛋白靈敏度大于1∶12 800,HeV-G蛋白靈敏度大于1∶6 400(圖6A),Western blot試驗證實隨著血清稀釋度的增加,其條帶逐漸變弱(圖6B),與iELISA靈敏性試驗結果一致。特異性檢測發現該方法對非洲馬瘟病毒、西尼羅病毒、馬梨形蟲、馬傳染性貧血病毒、馬媾疫錐蟲、馬鼻疽桿菌等陽性血清均不發生交叉反應(圖7),所建間接iELISA檢測方法特異性良好。批內和批間重復性進行檢測(表1～表2),發現HeV-N和HeV-G蛋白批內、批間變異系數均小于10%,說明建立的ELISA方法具有良好的重復性。

表1 批內重復性試驗結果

表2 批間重復性試驗結果

1.HeV-N、HeV-G陽性樣本;2.非洲馬瘟病毒;3～4.西尼羅病毒;5.馬梨形蟲;6～7.馬傳貧病毒;8.馬媾疫錐蟲;9～10.馬鼻疽桿菌

2.7 iELISA檢測方法準確性的檢測

HeV-N和HeV-G兩種iELISA方法所繪制的檢測樣本ROC曲線見圖8,其中HeV-N蛋白的曲線下面積為0.91,臨界值為0.22,敏感度0.77,特異性0.58,95%置信區間為80.2%～101.5%;HeV-G蛋白的曲線下面積為0.93,臨界值為0.27,敏感度0.88,特異性0.60,95%置信區間為79.5%～105.9%,二者的陽性樣本指數均高于閾值,說明所建立的iELISA方法具有良好的準確性。

A.HeV-N ROC曲線圖;B.HeV-G ROC曲線圖

3 討論

馬亨德拉病毒于1994年在澳大利亞昆士蘭州亨德拉郊區的馬匹上首次被分離,隨后證實狐蝠(蝙蝠的一種)是該病毒的宿主動物,由于狐蝠具有很強的飛行能力,其冬眠和社會行為也有利于病毒的保存、進化和傳播,因此HeV具有擴散外溢的風險,自2006年以來澳大利亞每年都有該病發生的記錄[7]。此外,又由于該病毒對人也具有致病力,感染后病死率很高,盡管目前尚未在我國出現,但口岸、海關以及出入境檢驗檢疫部門已將該病毒作為入關必 檢的病原之一[8]。

馬感染HeV后在急性期和抗體產生之前就發生死亡或被安樂死,HeV的核酸檢測是確認臨床病例診斷方法[9],當前RT-PCR和實時熒光定量PCR被普遍采用[8]。血清學檢測方法具有優勢并可作為核酸檢測的補充[10],尤其在引入HeV疫苗后,血清學檢測是評估疫苗免疫效果的必要手段,也可對動物的感染情況進行檢測。針對HeV開展血清學檢測可作為我國出入境檢驗檢疫部分的儲備技術。

HeV中的G蛋白可刺激動物產生中和抗體,作為包被抗原建立ELISA方法可對接種過疫苗的馬進行抗體水平檢測,但該方法無法區分抗體是自然感染產生的還是接種疫苗產生的抗體;而HeV的N蛋白則不受疫苗的影響,基于N蛋白單克隆抗體的捕獲ELISA獲得成功[7]。本試驗針對G和N兩種蛋白分別建立其iELISA診斷方法,這對于評估HeV的感染及疫苗免疫情況的判斷是有益的。HeV的培養需要在BSL-4級生物安全實驗室中進行,因此獲取病毒樣本極其嚴苛,本試驗采用人工合成方式,對其序列進行密碼子優化,使其能夠在大腸埃希氏菌表達系統中得以高效表達,以往研究中也是采用此方法[11]。

對建立的iELISA方法進行特異性、靈敏性、重復性和準確性等參數的評估,該方法可以準確識別免疫后的陽性血清,而對陰性血清及其他物種血清不識別且無交叉反應,說明該方法具有良好的臨床應用價值。因我國沒有標準的HeV陽性血清,且臨床中也無可利用的陽性動物,因而未能用陽性臨床樣本對其進行檢驗,有待進一步優化[12],缺乏足夠量的陽性血清對評估血清學診斷方法有一定的限制作用。