一株兔源大腸埃希氏菌噬菌體的分離及生物學特性分析

屈平平,王一鳴,解紅梅,溫華梅,李 濤

(山東畜牧獸醫職業學院,山東濰坊 261061)

噬菌體(Phage)作為細菌的天然“殺手”,對細菌具有特異性裂解作用,且不易出現耐藥性,在自然界廣泛存在,容易獲取和大規模生產,在疾病防控、環境消毒、水產養殖、食品保存等方面具有很高的利用價值[1-4]。本研究以前期分離鑒定的兔致病性大腸埃希氏菌為宿主菌,采用點滴法和雙層瓊脂平板法,從山東規?；馔灭B殖場污水中篩選出效價高、裂解譜廣、抗逆性強的噬菌體,旨在將其開發為一種抗生素替代品和新型環境消毒劑,用于肉兔大腸桿菌病的防控,對于推進肉兔養殖意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 污水 從山東地區(青島、濰坊、臨沂、萊蕪)肉兔養殖較為密集的養殖場周邊收集污水。

1.1.2 細菌 用于篩選噬菌體的11株兔腸源致病性大腸埃希氏菌(tE1-tE11),用于測定噬菌體裂解譜的22株兔腸源致病性大腸埃希氏菌(tE1-tE11,ATE1-ATE11),2株雞源致病性大腸埃希氏菌(SJE1-SJE2),產腸毒素性大腸埃希氏菌標準株K88和K99,均為濰坊市特種經濟動物健康養殖關鍵技術重點實驗室分離鑒定與保存。

1.1.3 主要試劑 麥康凱培養基、營養瓊脂液體培養基、營養瓊脂固體培養基,北京路橋技術有限公司產品;濃鹽酸、NaOH,煙臺遠東精細化工有限公司產品。

1.1.4 主要儀器 氣浴恒溫振蕩器(THZ-100),電熱恒溫水浴鍋(HWS-28),均為上海一恒科學儀器有限公司產品;透射電子顯微鏡(HT7700型),為日立(中國)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體原液制備 將污水12 000 r/min離心10 min去除大部分固體雜質,上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。將0.1 mL污水過濾液加入10 mL LB液體培養基中,再加入0.1 mL宿主菌,在氣浴恒溫振蕩器37℃、180 r/min振蕩培養過夜,次日將培養液8 000 r/min離心15 min,取上清,經0.22 μm微孔濾膜過濾,得到噬菌體原液,4℃冰箱保存備用。

1.2.2 噬菌體的初選 取100 μL宿主菌菌懸液均勻涂布于 LB固體培養基平板上,在平板背面畫出分割線并進行標號,根據平板標號點滴噬菌體原液,每個標號方格中滴加10 μL,37℃恒溫培養箱過夜培養,觀察有無空斑出現。將空斑大而透亮的樣品4℃冰箱保存備用。

1.2.3 噬菌體的分離與純化 將空斑用無菌眼科手術鑷扣出,加入10 mL LB液體培養基,再加入100 μL大腸埃希氏菌菌懸液,37℃、180 r/min振蕩培養過夜,次日將噬菌體原液過0.22 μm微孔濾膜過濾,得到噬菌體過濾液,然后進行梯度稀釋,取0.1 mL合適梯度噬菌體稀釋液與0.2 mL宿主菌種子液混合,加入4 mL 約50℃ LB半固體培養基,混勻后倒入LB平板上,平板凝固后倒置于37℃培養箱4～6 h觀察有無噬菌斑。將出現噬菌斑樣品4℃冰箱保存備用,并利用雙層平板法重復3～5次,得到純化的噬菌體。

1.2.4 噬菌體電鏡觀察 取15 μL噬菌體過濾液滴于銅網上,靜置15 min,用濾紙吸干多余液體,然后加2%磷鎢酸染色10 min,干燥后通過透射電子顯微鏡觀察其形態。根據《根據國際病毒分類委員會(ICTV)在2011年發布的第9次報告中噬菌體的分類與命名標準》[5]和相關文獻對噬菌體進行分類和命名[6]。

1.2.5 大腸埃希氏菌噬菌體最佳感染復數測定 將宿主菌的濃度調整為1.0×107CFU/mL。MOI分別設定0.001、0.01、0.1、1、10、100,分別取500 μL噬菌體液和500 μL宿主菌菌液加入9 mL LB液體培養基,在氣浴恒溫振蕩器37℃、180 r/min 振蕩培養6～8 h。將混合培養物12 000 r/min離心5 min,取上清液,經0.22 μm微孔濾膜過濾,保留過濾液,測定噬菌體效價。每個MOI值,做3個重復,產生最高效價的感染復數即為噬菌體的最佳MOI。

1.2.6 大腸埃希氏菌噬菌體一步生長曲線測定 將宿主菌濃度調整為在107CFU/mL左右,將噬菌體液與宿主菌液以最佳感染復數的比例在37℃水浴鍋中孵育5 min后;12 000 r/min 離心1 min,去上清,LB液體培養基洗滌3次,將洗滌后的溶液加入100 mL LB液體培養基,充分混勻后于氣浴恒溫振蕩器37℃振蕩培養;從0 min開始取樣,每隔20 min 取樣1次,至160 min,測定噬菌體的效價,每個試驗設3個重復。

1.2.7 大腸埃希氏菌噬菌體溫度穩定性測定 將盛有500 μL噬菌體的離心管分別放置于溫度為40、50、60、70℃的電熱恒溫水浴鍋中,分別在30 min和60 min后取樣,用雙層平板法分別測定噬菌體效價變化,每個試驗設3個重復。

1.2.8 大腸埃希氏菌噬菌體pH穩定性測定 用濃鹽酸和NaOH溶液調整LB液體培養基的pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11,每個pH均取200 μL,加入200 μL 109pfu/mL 的噬菌體液混勻,混勻后于37℃電熱恒溫水浴鍋作用1 h。利用雙層平板法測定噬菌體效價,每個試驗設3個重復。

1.2.9 大腸埃希氏菌噬菌體裂解譜測定 利用密集畫線法將對數生長期的菌液均勻涂布于LB平板上,待干后,取5 μL噬菌體液滴在平板上,37℃恒溫培養箱過夜培養,次日觀察平板出現空斑的情況。若空斑大而透亮,說明噬菌體可徹底裂解該菌,記為++;若空斑比較模糊,或空白內仍有少量菌落,說明噬菌體不能徹底裂解該菌,記為+;若無空斑,說明噬菌體不能裂解該菌,記為-。

2 結果

2.1 噬菌體分離與純化結果

用滴定法篩選出1株以兔致病性大腸埃希氏菌tE10為宿主菌的噬菌體,該噬菌體所出現的空斑大而透亮(圖1),利用雙層平板法對該噬菌體進行分離和純化,得到的噬菌斑呈圓形,直徑2～2.5 mm,邊緣整齊無暈環,完全透亮(圖2)。

圖1 噬菌體所形成的空斑

圖2 噬菌體的噬菌斑形態

2.2 噬菌體的電鏡觀察結果

通過透射電鏡觀察到該噬菌體,頭部呈20面體,長徑約52.5 nm,橫徑約51.6 nm,尾部長約86.9 nm,有明顯的頸部(圖3)。從形態和結構上可初步判定該株噬菌體均為有尾噬菌體目,長尾噬菌體科,將本噬菌體命名為vB-EcoS-tE10。

圖3 噬菌體vB-EcoS-tE10電鏡形態

2.3 最佳感染復數及一步生長曲線的測定

當MOI=0.1時,噬菌體vB-EcoS-tE10產生子代數量最多,效價為7.2×109PFU/mL,該噬菌體的最佳MOI=0.1(表1)。該株噬菌體在前20 min效價穩定,40 min后迅速上升,80 min到達峰值后至120 min保持平穩,120 min后效價略有下降,可知該株噬菌體潛伏期為20 min,暴發期為80 min,裂解量為608 PFU/cell(表2)。

表1 最佳感染復數

表2 一步生長曲線

2.4 溫度及酸堿穩定性

該噬菌體在30℃和40℃作用30 min和60 min,效價幾乎沒有變化;在50℃作用30 min和60 min,效價僅下降了一個數量級;但在60℃和70℃作用下,隨時間延長,噬菌體效價急劇下降(表3),該噬菌體可在pH4～10之間存活,在pH為6～9范圍內可保持很高的效價(表4)。

表3 噬菌體熱耐受性

表4 噬菌體pH耐受性

2.5 噬菌體裂解譜的測定

該噬菌體可裂解宿主菌tE10,還可裂解8株兔源大腸埃希氏菌(tE1、tE2、tE5、tE6、ATE5、ATE9、ATE10、ATE11)、1株雞源大腸埃希氏菌(SJE1)和1株產腸毒素性大腸埃希氏菌標準株K99,裂解率為11/26(42.31%),具有較寬的裂解譜(表5)。

表5 噬菌體對大腸埃希氏菌的裂解能力

3 討論

本試驗篩選的大腸埃希氏菌噬菌體為有尾目、長尾科,與禽源、豬源、牛羊源大腸埃希氏菌噬菌體在形態上相似[7-9],符合大腸埃希氏菌噬菌體的一般特征。有研究從腹瀉死兔肝臟中分離出1株致病性大腸埃希氏菌ZR1,并以ZR1為宿主菌,篩選出1株噬菌體ZRP1,該噬菌體的潛伏期為25～20 min,裂解量約144 PFU/cell[10]。也有研究以兔致病性大腸埃希氏菌ZJE1為宿主菌,分離到5株噬菌體ZRP1、ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,其中噬菌體ZRP2潛伏期為16～19 min,裂解量約為150 PFU/cell,噬菌體ZRP3潛伏期為11～14 min,裂解量約為110 PFU/cell,噬菌體ZRP4潛伏期為16～19 min,裂解量約為170 PFU/cell[11]。本試驗篩選的大腸埃希氏菌噬菌體vB-EcoS-tE10潛伏期約為20 min,裂解量為608 PFU/cell,與以上大腸埃希氏菌噬菌體相比,潛伏期差異不大,但裂解量是上述噬菌體的4～5倍。因此該噬菌體的裂解能力較強,開發利用價值更高。

適宜的pH和溫度是噬菌體保持活性的關鍵。大腸埃希氏菌噬菌體vB-EcoM-tE10在30～50℃效價幾乎不受影響,在60℃作用30 min和60 min效價有所下降,在pH 4～10范圍內可以存活,在pH為6～9均保持很高的效價,對熱和酸堿的耐受性更強[12-13],這種性能更有利于噬菌體制劑的長期保存和商業化生產。

大部分噬菌體裂解細菌的特異性較強,在一定程度上限制了噬菌體使用,但是自然界中多價寬譜噬菌體也存在[14]。本試驗篩選的大腸埃希氏菌噬菌體對兔源致病性大腸埃希氏菌的裂解能力較強,還能裂解一株禽源致病性大腸埃希氏菌和一株產腸毒素性大腸埃希氏菌K99,可能該株噬菌體具有識別以上細菌的特殊結構或者分泌某種能夠裂解以上細菌的活性物質,需要對該噬菌體進行全基因序列分析,與其他多價寬譜大腸埃希氏菌噬菌體進行比對,從基因水平探究噬菌體能裂解多株細菌的機制,為噬菌體開發利用提供新的思路。