歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒GD2022株的分離鑒定及遺傳進化分析

鄧可輝,王修武,郭智軒,韓淑杰,孫守湖,賀東生*

(1.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心,廣東肇慶 526238;2.華南農業大學獸醫學院/廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室,廣東廣州 510640)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可引起豬高病死率,為烈性接觸性傳染病,其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),也稱為豬藍耳病病毒。PRRSV為單股正鏈RNA病毒,自2018年歸屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)、β-動脈炎病毒屬(Betaarterivirus)[1]。PRRSV基因組全長約15000 nt,包含10個開放閱讀框(open reading frames,ORFs),分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b,ORF3～ORF7及ORF5a。PRRSV全基因組編碼11種非結構蛋白、6種結構蛋白[2],其中GP5蛋白具有很高變異性,同時GP3和GP4重疊區域缺失在PRRSV-1中較為常見。

根據國際病毒分類委員會(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)對動脈炎病毒科最新的歸納總結,顯示PRRSV已經被定義為兩種不同的病原,分別以Lelystad virus(LV)為代表的PRRSV-1(Betaarterivirussuid1)和以VR-2332為代表的PRRSV-2(Betaarterivirussuid2)[3],這兩種病原引起的疾病癥狀相似,但抗原性差異較大,全基因組核苷酸同源性約60%,且致病性差異較大。國內首株PRRSV-1在2006年分離,隨后相繼分離出多株PRRSV-1毒株[4],目前在我國流行的大多為PRRSV-2,對PRRSV-1的深入研究較少。

本研究從2022年廣東省某規?；i場流產母豬病料中檢測到PRRSV-1,并分離1株PRRSV-1毒株,命名為GD2022株,對其全基因組測序、遺傳進化及重組分析,進一步了解PRRSV-1毒株在我國的流行和變異情況,豐富了我國PRRSV-1的研究資料,為PRRSV-1的深入研究及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和病毒 2022年12月,華南地區某2 000頭母豬場疑似PRRSV感染,母豬出現繁殖障礙問題持續4個月,發病豬場曾接種過PRRSV-2滅活苗,但無PRRSV-2弱毒苗的接種史,母豬出現流產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙癥狀,發病率約40%,保育豬出現被毛粗亂和呼吸道癥狀,整體病死和淘汰約50%。無菌采集發病豬肺臟、淋巴結、血清進行疫病檢測,置-80℃冰箱備用。PRRSV-1毒株GDEU2018由華南農業大學獸醫傳染病室保存。

1.1.2 細胞和主要試劑 豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)和Marc-145細胞由華南農業大學傳染病教研室保存;HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)酶、高保真酶、5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、DH5α感受態、DNA純化試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品;質粒小量提取試劑盒,廣州飛揚生物工程有限公司產品;RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒,上海飛捷生物技術有限公司產品;PRRSV N蛋白單抗,千尋生物技術有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機,Eppendorf公司產品;倒置顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司產品;倒置熒光顯微鏡、二氧化碳恒溫培養箱,Thermo Fisher Scientific公司產品;凝膠成像系統,上海天能科技有限公司產品;PCR儀,Bio-Rad公司產品;透射電子顯微鏡,HITACHI公司產品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 收集的病料(肺臟或血清)加入無菌PBS緩沖液稀釋,低溫充分研磨,在-80℃反復凍融3次,4℃、14 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm針頭過濾器濾菌,置-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物的設計與合成 參考GenBank所收錄的PRRSV-1和PRRSV-2代表毒株基因序列(參考毒株:VR2332,GenBank登錄號:U87392;LV,GenBank登錄號:M96262)設計2對檢測引物。根據GenBank中收錄的國內PRRSV-1全基因序列,比對后選擇相對保守區域進行全基因片段擴增引物設計,共設計10對擴增PRRSV全基因引物(參考毒株:GZ11-G1,GenBank登錄號:KF001144.1),引物序列均由北京擎科生物科技有限公司廣州分公司合成(純化方式:OPC)(表1),表1中1～10為全基因引物,11為PRRSV-1鑒定引物,12為PRRSV-2鑒定引物。

表1 引物序列信息

1.2.3 病料檢測 參照商品化核酸提取試劑盒說明書對處理好的樣品進行病毒核酸提取,用表1鑒定引物進行RT-PCR,所得產物通過1%瓊脂糖核酸電泳進行鑒定。檢測陽性的核酸,用HiScript Ⅲ cDNA合成試劑盒反轉錄為cDNA,置于-20℃低溫冰箱保存備用。

1.2.4 病原分離 取陽性樣品按照病料與培養基1∶10分別接種于PAMs和Marc-145細胞,同時設2組陰性對照組,在體積分數為5% CO2、37℃溫箱中孵育2 h。棄上清更換維持液,體積分數為5% CO2、37℃溫箱中培養5～7 d后收毒,反復凍融3次,盲傳3～5代,期間若有典型細胞病變(cytopathic effect,CPE)出現,拍照記錄結果,并進行RT-PCR檢測。

1.2.5 分離株間接免疫熒光鑒定 將第10代含病毒的細胞培養液上清接種PAMs,同時設置正常對照,當CPE達到80%以上時用4%多聚甲醛室溫固定15 min,然后加入0.3%曲拉通室溫作用30 min,再用50 mL/L BSA室溫封閉1 h,與稀釋1 000倍的PRRSV N蛋白單克隆抗體4℃作用10 h,用稀釋1 000倍的山羊抗鼠IgG在37℃避光作用1 h,最后加入DAPI遮光作用5 min,用倒置熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.6 分離株病毒滴度測定 用鋪滿單層PAMs的96孔細胞培養板進行病毒滴度測定。將在PAMs上傳代的第10代病毒,用含5% FBS的RPMI1640培養基10倍倍比稀釋,取10-1～10-10病毒液分別接種96孔細胞培養板。每個稀釋度接種8孔,每孔100 μL。同時設8孔陰性對照,每孔再補加100 μL維持培養基。置于體積分數5% CO2細胞培養箱中37℃培養,每日觀察細胞病變(CPE),連續觀察4～5 d,記錄每個稀釋度出現CPE的孔數。采用Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.7 病毒形態結構觀察 將接毒后的PAMs培養72 h后,反復凍融3次,4℃條件下14 000 r/min離心10 min,去掉細胞碎片。取病毒懸液,滴在碳膜銅網放置5 min,用濾紙吸去多余液體,將2%磷鎢酸滴在碳支持膜銅網放置2 min,用濾紙吸去多余液體,室溫干燥。透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.2.8 全基因組擴增及測序 取陽性病料cDNA,根據表1的引物,用高保真酶進行PCR擴增以獲得病毒的基因組各片段,PCR反應程序為:95℃ 3 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃延伸2 min 10 s,共35個循環;最后72℃延伸5 min。所得PCR產物通過1%瓊脂糖核酸電泳進行鑒定。參照諾唯贊膠回收試劑盒回收PCR產物,將PCR產物連接pCE2 TA/Blunt-Zero載體,并把連接產物轉化至DH5α感受態細胞,挑取單個菌落置于1 mL含氨芐抗性的LB液體培養基中過夜培養,菌液PCR鑒定陽性的陽性菌送至北京擎科生物科技有限公司廣州分公司進行序列測定。

1.2.9 分離株的全基因組序列分析 用生物學軟件對分段克隆的10條相互重疊的基因片段進行全基因序列拼接,得到分離株的全基因序列。用DNAstar軟件中的MegAlign7.1(Clustal W)對PRRSV分離株的全基因組序列和國內外58株參考毒株全基因組序列進行核苷酸序列和編碼氨基酸序列的同源性比對分析。用MEGA7.0軟件(Clustal W Method分析,Neighbor-Joining Method,Bootstrap method值為1000)進行全基因組以及ORF5基因遺傳進化分析并繪制系統遺傳進化樹。用RDP4.0軟件對分離株GD2022株和58株參考株進行全基因組序列重組分析。

2 結果

2.1 病原的分離結果

第5代病毒接種PAMs,48 h后開始出現CPE,上清液RT-PCR檢測為PRRSV1陽性;第8代病毒接種PAMs,48 h內可見細胞皺縮,細胞破碎等典型CPE(圖1A);正常PAMs狀態良好(圖1B);接種Marc-145組無CPE現象,且RT-PCR檢測為陰性。疑似從PRRSV陽性樣品中成功分離1株病毒,命名為GD2022株。

A.接毒后的PAMs; B.正常的PAMs

2.2 分離毒株的RT-PCR鑒定結果

對第10代病毒分別用豬細小病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒、1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物進行RT-PCR鑒定。結果顯示檢測的第10代病毒中只有1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒為陽性,其目的條帶大小與預期條帶大小一致,而豬細小病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒5種常見會引起繁殖障礙的病毒均為陰性(圖2)。該結果初步表明,分離的病毒為PRRSV-1。

M.DNA標準DL 1 000; 1.陽性對照; 2.GD2022第10代病毒; 3.PRRSV-2; 4.CSFV; 5.PRV; 6.JEV; 7.PPV; 8.陰性對照

2.3 分離株間接免疫熒光鑒定

將第10代病毒樣品接種PAMs,36 h后可見明顯CPE,IFA試驗結果顯示,接毒組可檢測到針對PRRSV N蛋白的特異性熒光(圖3A),而對照組則無特異性熒光(圖3C),表明所分離病毒為PRRSV。

A～B.PRRSV-1毒株接種PAMs;C～D.陰性對照

2.4 分離株病毒滴度測定

經TCID50測定,GD2022株在PAMs上第10代的病毒含量為106.75TCID50/mL。

2.5 病毒形態學結構觀察

病毒樣品經負染在透射電子顯微鏡下可見圓形或橢圓型的病毒粒子,直徑約40～80 nm(圖4)。

圖4 病毒粒子透射電鏡觀察

2.6 全基因序列擴增結果

以陽性病料的cDNA為模板,用表1的特異性引物擴增病毒基因組的重疊片段,并連接pCE2 TA/Blunt-Zero載體,結果分段擴增該毒株的基因組片段成功構建重組質粒,各片段重組質粒通過通用引物驗證,各片段大小與預期相符(圖5)。

M.DNA標準DL 5 000; 1～10.片段1～10

2.7 全基因組測序結果

各片段測序結果通過生物學軟件拼接校正后,得到GD2022株基因組全長為15058個核苷酸(不含polyA尾)5′UTR長222 nt,3′UTR長114 nt,與公布的PRRSV-1序列長度相似,全基因序列已上傳GenBank,登錄號為OQ606399。

2.8 全基因組同源性分析

用MegAlign7.1和MEGA7.0軟件對GD2022和58株國內外PRRSV參考毒株進行核苷酸序列同源性分析,結果分離株GD2022與PRRSV-1毒株同源性為77.4%～87.0%,與PRRSV-1代表毒株(LV株)同源性最高為87.0%,與PRRSV-2代表毒株(VR2332株)同源性僅為59.7%。

2.9 全基因組遺傳進化分析

GD2022株全基因序列與國內外55株PRRSV參考毒株全基因組進行遺傳進化分析。PRRSV被定義為兩種不同的病原,LV為代表的PRRSV-1(歐洲型)和以VR-2332為代表的PRRSV-2(美洲型),PRRSV-2單獨成一分支。遺傳進化樹結果顯示,GD2022株處于PRRSV-1大分支中的一小分支,且與PRRSV-1疫苗毒遺傳關系較遠(圖6)。圖6中“●”為GD2022株,“▲”為PRRSV-1疫苗毒株?；贠RF5基因進行的遺傳進化分析,結果顯示分離株與報道的PRRSV-1毒株均屬1亞型,但在遺傳進化樹中單獨成一分支(圖7),圖7中“●”為GD2022株。

圖6 PRRSV全長基因組序列的遺傳進化分析

圖7 基于ORF5基因的遺傳進化分析

2.10 編碼蛋白的缺失與突變結果分析

將GD2022毒株GP3、GP4和GP5編碼蛋白的氨基酸序列與國內毒株和經典毒株(LV株)進行比較分析。GD2022毒株在ORF3和ORF4重疊區域有3個核苷酸(nt)缺失,導致GP3和GP4蛋白分別在第245和第65aa位點缺失了1個氨基酸(圖8A和圖8B);ORF5基因編碼的GP5蛋白氨基酸序列與LV株比較,在GP5蛋白中和抗原表位有1處發生突變,即第33氨基酸位點(D→A),在高變區有2處發生突變,第56氨基酸位點(D→A)和第63氨基酸位點(G→D)(圖8C)。

圖8 GP3、GP4、GP5結構蛋白的氨基酸序列比對

2.11 重組分析

在默認參數下用RDP4軟件7種檢測方法(RDP、GENCONV、MaxChi、Chimaera、BootScan、3Seq、SiScan)進行重組分析,結果顯示GD2022株無重組事件發生,推測GD2022株不存在重組現象。通過一系列驗證GD2022株為1株PRRSV新毒株。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征給全球養豬業帶來了嚴重的經濟損失[5]。早在20世紀80年代美國首次報道PRRSV,20世紀90年代傳進我國,在我國豬群中長期流行并發生廣泛變異[6-7]。隨后國內多地豬群都相繼感染該病毒[8]。相比PRRSV-2,我國首株PRRSV-1報道較晚,2006年首次分離鑒定,隨后國內多地報道PRRSV-1毒株的出現[9],表明PRRSV-1和PRRSV-2在我國豬群中同時存在[10]。由于PRRSV免疫交叉保護弱和容易發生重組[11],我國對PRRSV-1的流行情況、遺傳變異等相關研究較少,需關注和監測PRRSV-1在國內的流行情況[12]。

針對廣東某規?；i場繁殖障礙母豬進行了采樣檢測,對引起繁殖障礙的常見病原進行檢測(包括豬細小病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒),結果均為陰性,綜合各種臨床表現,懷疑豬群感染了PRRSV-1。經過檢測確診豬群為PRRSV-1感染,并用PAMs對陽性病料進行病原的分離,最后成功分離1株PRRSV-1,命名為GD2022株。為了更好了解PRRSV-1在我國流行的動態和遺傳進化信息,對GD2022株進行了全基因測序及序列分析。通過基因克隆、測序、拼接,得到GD2022毒株的全基因組序列,全長為15058個核苷酸(不含polyA尾)5′UTR長222 nt,3′UTR長114 nt,全基因序列已上傳至GenBank(登錄號:OQ606399),豐富了國內PRRSV-1的全基因序列的數據庫。通過序列分析比較,發現該毒株GP3和GP4編碼蛋白重疊區分別在第245 aa位和第65 aa位缺失了1個氨基酸,GP5蛋白高變區有兩處發生了突變,為第56 aa位(D→A)和第63 aa位(G→D),這種缺失和變異的出現與國內的其他PRRSV-1參考毒株有所區別,顯示了PRRSV-1的持續變異性,但所發現的位點突變對PRRSV的毒力、致病性等影響目前尚不清楚,需進一步研究。

本研究所分離毒株GD2022株基因組同源性分析結果、系統遺傳進化樹結果和中和抗原表位的突變等均顯示其與國外疫苗毒株存在顯著差異,國內尚未見商品化的PRRSV-1疫苗,即使采用國外疫苗進行免疫,根據上述變異結果推測其對豬群所提供的的保護作用可能也不夠,因此,該毒株的成功分離為后期PRRSV致病機制研究、診斷制劑和新型疫苗的研發打下了基礎。