馬麝出血癥組織滅活疫苗的制備及免疫保護性分析

馬海云,張玉清,郭潞莎,包世俊

(甘肅農業大學動物醫學學院,甘肅蘭州 730070)

馬麝(Moschuschrysogaster,alpine musk deer)亦稱香樟、高山麝,是我國特有的麝科、麝屬、麝種動物,也是我國一級重點保護野生動物,被列入世界自然保護聯盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN) “瀕?！币吧鷦游颷1-2]。麝香是雄麝香腺囊的分泌物,是香水工業中最古老的原料之一,亦是我國名貴的中藥材,對神經系統和心血管系統有興奮作用,被用作許多中藥名方如麝香保心丸、六神丸、云南白藥等[3]。迄今為止,很難找到合適的天然或合成物質來替代傳統醫學中的麝香,因此麝香有極高的經濟與藥用價值。馬麝在我國青海、寧夏、甘肅、四川、云南等地均有分布,其主要棲息在裸巖山地的灌木叢和草叢等地,是典型的灌木叢、森林邊緣動物[2],由于過度獵捕和棲息地的破壞,我國馬麝種群數量急劇減少。為了保護我國獨特的麝資源,20世紀90年代初,甘肅興隆山國家級自然保護區建立了第1家馬麝養殖場,目前保護區馬麝是我國數量最大的種群。但多種傳染性疾病的流行嚴重影響馬麝養殖和繁育。

馬麝病毒性出血癥是急性和高度致死性傳染病,以馬麝心、肝、脾、肺、腎、小腸、腦等組織和器官充血、出血和壞死為特征。通常1歲內最常發病,6月齡左右病死率較高,大多數病例死于無癥狀,一些病程稍長的表現為抑郁,停止進食和飲水,并伴有角弓反張等神經系統癥狀[4-6]。采集病料研究確定馬麝出血癥的病原為一種杯狀病毒[7],與兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diease virus,RHDV)的核酸序列高度相似,尤其與RHDV中國分離株HB株的相似性高達98.7%,且能夠感染并致死家兔,因此,該病毒曾被命名為馬麝出血癥病毒[8]。為提高對馬麝出血癥的防控能力,需研制可用于馬麝出血癥有效預防的疫苗,本文用家兔擴增馬麝出血癥病毒的基礎上,收集致死兔肝臟,制備病毒的肝臟組織勻漿上清,并經甲醛滅活后用白油佐劑配制馬麝出血癥的組織滅活疫苗,進而評價疫苗的免疫效果和保護效果,為馬麝出血癥的疫苗防控提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與實驗動物 馬麝出血癥病毒(McHDV)毒株由甘肅農業大學傳染病學實驗室從我國興隆山馬麝繁育基地病死馬麝體內分離保存;人“O”型紅細胞來源于血站;健康非免疫新西蘭白兔購于甘肅省蘭州市某個體養殖戶。

1.1.2 主要試劑 兔瘟-巴氏桿菌二聯苗;白油佐劑;甲醛溶液(40%)Biosharp; NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸等化學試劑,上海生工生物工程技術服務公司產品;PBS緩沖液:NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO41.84 g、Na2HPO40.2 g,蒸餾水定容至100 mL,用pH檢測儀測定pH為7.4,取10 mL 10×PBS緩沖液于90 mL蒸餾水中,配制成1×PBS緩沖液,調用pH至7.2。1% 紅細胞懸液:吸取1 mL抗凝血于2 mL離心管,1 500 r/min離心10 min,棄去血漿,紅細胞沉淀中加入1×PBS緩沖液(紅細胞體積的2倍),輕晃,洗滌紅細胞(上下輕晃,直至紅細胞均勻),1 500 r/min離心10 min,棄上清,反復洗滌多次,直至上清清亮無色,按照紅細胞體積1∶100的比例加入1×PBS,配制1%紅細胞懸液,并置于4℃冰箱保存備用。

1.1.3 主要儀器 高壓鍋(LDZX-50KBS),上海申安醫療器械廠生產;超凈工作臺(ZHJH-1112),上海智城分析儀器制造有限公司生產;電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司產品;離心機,上海南榮實驗室設備有限公司產品;微型振蕩器(MM-1),臺州市艾測儀器有限公司產品;恒溫培養箱,上海躍進醫療器械有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 ①病料的處理。取實驗室凍存的病料,加10倍體積1×PBS緩沖液制備組織勻漿,反復凍融3次,10 000 r/min離心10 min,取上清除菌后皮下注射2只健康非免疫新西蘭大白兔,1 mL/只,觀察并記錄試驗兔的臨床癥狀和病理變化。無菌采取死亡兔的肝臟組織,除去脂肪和結締組織,稱量后充分研磨,與1×PBS緩沖液按1∶10的比例混合后勻漿,反復凍融3次后10 000 r/min離心15 min,取上清,用0.22 μm除菌過濾過濾除菌后分裝備用。②毒種檢驗(血凝試驗)。應用血凝試驗測定病毒懸液的效價,試驗設3個平行組,并于96孔V型板上進行:1～12孔先加入25 μL 1×PBS緩沖液;取25 μL病毒懸液加入第1孔后倍比稀釋到11孔,從11孔吸棄25 μL,12孔為空白對照;每孔加入1%紅細胞懸液25 μL,置4℃ 45 min后判定結果。③滅活疫苗的制備。將毒種檢驗測定的血凝效價為8 Log2的病毒懸液作為候選毒株,向處理分裝過后的病料懸液中加入40%甲醛(使其終濃度為0.4%),置37℃振搖滅活48 h,可4℃保存(未加佐劑組織滅活苗),滅活振搖后的組織懸液與白油佐劑按照1∶1的比例混合均勻后,置于乳化機乳化30 s,重復3～4次使之充分乳化。

1.2.2 疫苗檢驗 ①無菌檢驗。取制得的疫苗,分別在血液瓊脂培養基和普通培養基上劃線,37℃培養48 h,若無雜菌生成,則該疫苗合格,按照《中華人民共和國獸用生物制品規程》附錄進行。②滅活苗物理性狀檢驗。將滅活疫苗3 000 r/min離心10 min,觀察其分層情況。取少量滅活疫苗滴于蒸餾水表面,觀察疫苗的擴散情況。③安全性檢驗。取健康非免疫新西蘭大白兔4只,每只皮下接種制得的疫苗4 mL,連續觀察14 d,分析疫苗的安全性。④免疫效力檢測——血清抗體水平檢測。取12只健康非免疫兔,隨機分為4組,每組3只,試驗組分別皮下注射1 mL未加佐劑組織滅活苗、白油佐劑組織滅活苗,對照組皮下注射1 mL PBS緩沖液,商品苗對照組皮下注射1 mL商品苗。免疫后0、7、14 d于兔子耳緣靜脈采血,采集的血液放于37℃溫箱30 min后,3 000 r/min離心10 min,上清液即為分離的血清。對所分離的血清進行處理,將所有血清置于56℃水浴鍋中30 min滅活。血凝抑制試驗,在96孔V型板上1～11孔加入25 μL PBS緩沖液,第12孔加入50 μL PBS緩沖液,將待檢血清加入第1孔開始倍比稀釋到11孔棄去,1～11孔加入4單位病毒(4單位病毒的配制:以血凝試驗的結果為依據,抗原的血凝效價為8 Log2,因此1個HAU為8 Log2,4個HAU為6 Log2,即4單位抗原的稀釋倍數為1∶64),置于微型振蕩器上搖勻,振蕩3 min,37℃溫箱放置30 min,向每孔加入25 μL 1%紅細胞懸液,振蕩混勻,4℃放置45 min,待PBS對照孔的紅細胞完全沉積后觀察并判定結果。試驗同時設陽性血清、陰性血清和空白對照。⑤攻毒保護試驗。對免疫14 d后的各組兔子皮下注射強毒(含1 000 LD50)1 mL,觀察其7 d的狀況,記錄各組兔子的發病和死亡情況,計算保護率。

2 結果

2.1 滅活疫苗物理性狀及安全性試驗結果

制備的滅活疫苗經離心,未出現分層現象,證明乳化充分。經血瓊脂培養基和普通培養基培養后,無雜菌生長。制備的滅活疫苗物理性狀成乳白色,將疫苗滴于蒸餾水上呈圓形油滴狀,無分散現象。健康非免疫新西蘭大白兔頸部皮下注射制備的疫苗,觀察14 d,無不良反應和異常表現,表明制備的滅活疫苗具有良好的安全性。

2.2 血凝抑制試驗與攻毒保護結果

第7天未加佐劑組織滅活疫苗組的效價分別為6 Log2、7 Log2、7 Log2,白油佐劑滅活疫苗組的效價分別為11 Log2、7 Log2、8 Log2,商品苗組的效價分別為8 Log2、7 Log2、7 Log2,對照組均無效價。第14 天未加佐劑組織滅活疫苗組的效價分別為8 Log2、7 Log2、7 Log2,白油佐劑滅活疫苗組的效價分別為11 Log2、9 Log2、9 Log2,商品苗組的效價分別為8 Log2、7 Log2、8 Log2,對照組均無效價(表1)。第7天未加佐劑的組織滅活疫苗組全部存活,白油佐劑滅活疫苗組死亡1只,商品苗組全部存活,對照組全部死亡(表2)。

表1 免疫兔血清第7天、第14天抗體效價變化

表2 不同免疫劑量對馬麝病毒的免疫保護結果

對照組在預計時間內全部死亡,死前精神沉郁,飲食欲廢絕,死后出現角弓反張現象。剖檢病死兔可見全身出現敗血性變化(圖1),病理剖檢可見“紅氣管”,氣管存在點狀出血、心臟淤血、肺臟出現淤血和大小不等的出血斑點、肝臟質脆和淤血、腎臟腫大和淤血很明顯等病理特征,根據臨床癥狀及剖檢病變特征確定死因是馬麝出血性病毒感染所致。

A～B.對照組兔心臟,心臟內有明顯淤血; C～D.對照組兔肺臟,明顯充血、淤血;E.對照組兔氣管,可見點狀出血,切開氣管時有淤血;F.對照組兔腎臟,存在明顯淤血,相較于正常腎臟較黑;G.對照組兔肝臟,質脆,明顯淤血

3 討論

關于麝屬動物的研究主要是通過樣線法、樣方法、糞堆計數法及重復法,對麝類種群空間分布、種群數量與密度、棲息地的保護、生存環境的選擇及適應性分析等進行調查、研究和分析,根據利害因素優化馬麝的生存環境,減少干擾因素[9-13]。馬麝疾病的治療研究較少,李斐然等[14]對林麝胃腸道(胃腸潰瘍、瘤胃遲緩、便秘)和泌尿道(尿道炎、膀胱結石)相關疾病的診治進行了探索和完善,為馬麝疾病診治和相關疫苗的研發提供一定的參考。馬麝病毒性出血癥發病急、致死率高,對馬麝種群的繁育和生存造成嚴重威脅[4]。本文主要研究馬麝病毒性出血癥滅活疫苗的制備,分為未加佐劑滅活組織疫苗和白油佐劑滅活組織疫苗,陽性對照組為商品疫苗組,陰性對照組皮下注射1 mL PBS緩沖液。結果證明疫苗無菌檢驗、物理性狀檢驗以及安全性檢驗符合要求。試驗過程中分別對試驗兔測定7 d、14 d的HI,結果顯示,相較于商品疫苗組,白油佐劑組在7 d、14 d均具有較高的效價,表明該疫苗可以在短時間產生較高效價,并且維持時間較長。未加佐劑組產生效價時間較慢,效價較低,但仍存在免疫效果。攻毒后對照組在預計時間內死亡,而試驗組兔存活,白油佐劑組死亡1只。在動物攻毒試驗中,未加佐劑組保護率為100%,白油佐劑組保護率為66.7%,商品疫苗組保護率為100%?？赡芘c試驗動物的個體差異、身體狀況、免疫耐受及周圍環境對試驗動物的影響等因素有關,本試驗中不同劑量免疫家兔時,每組僅用了3只兔子,未達到小動物試驗基本樣本數,沒有進行重復試驗,白油佐劑組死亡1只,造成白油佐劑組保護率降到66.7%。本試驗的攻毒保護結果說明疫苗切實可行,能夠起到免疫保護的作用。本試驗證明所制備疫苗有潛力應用于疫苗生產,降低生產成本。同時也有利于預防馬麝病毒性出血癥的發生和提高馬麝的存活率,從而對馬麝起到一定的保護作用,并為這一瀕危物種的繁殖提供有力保障。