2020-2021年我國規?；i場豬圓環病毒2型和3型的分子流行病學調查分析

陳翔鴻,曹 琪,諶 磊,鄧文芳,袁 意,孔丹妮,宋文博,2*,湯細彪*

(武漢科前生物股份有限公司,湖北武漢 430070;華中農業大學動物醫學院,湖北武漢 430070)

豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)為圓環病毒科圓環病毒屬,PCV主要有豬圓環病毒1型(Porcine circovirus,PCV1)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬圓環病毒3型(PCV3)和豬圓環病毒4型(Porcine circovirus,PCV4)[1-2]。PCV1是一種細胞培養污染物,與疾病沒有關聯。PCV2是豬圓環病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原[3]。PCV3可能與豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙 、心肌炎及多系統炎癥有關[4]。PCV4在我國湖南省幾頭患有嚴重呼吸道及腸道癥狀的豬中發現,并命名為PCV4[2]。PCV2包含2個主要的開放閱讀框ORF1和ORF2,分別編碼復制酶(Rep)和衣殼(Cap)蛋白,Cap蛋白是該病毒可誘導機體產生針對PCV2的中和抗體的一種重要的免疫原性蛋白[5]。與ORF1基因相比,ORF2基因表現出更多的遺傳變異,通?？勺鳛橄到y發育和流行病學標記?；赑CV2的ORF2中不同核苷酸位點比例將PCV2分為8個基因型,即PCV2a、b、c、d、e、f、g、h[6]。PCV3的基因組結構與PCV1和PCV2類似,ORF2 是變異最大的區域,編碼唯一的結構蛋白(Cap蛋白),與病毒的感染和免疫有較強的相關性。PCV3 Cap蛋白的氨基酸數為214個,比PCV2少19～29個,與PCV1和 PCV2的基因組核苷酸同源性僅為37%左右[7]?；贑ap蛋白氨基酸序列上第24位和第27位特異性氨基酸位點的差異,將PCV3分為PCV3a、PCV3b、PCV3c共3個基因型[8]。2012-2018年我國東南地區PCV2陽性率為41.9%(272/649),PCV2d檢出率為67.6%(184/272),其次為PCV2b、PCV2a、PCV2c和PCV2e[9]。2015-2018年豫南地區PCV2陽性率為27.39%(43/157),PCV2d占76.92%(10/13)[10]。2017-2018年華中地區PCV2感染率為68.53%(1091/1592),PCV2d占86.84%(33/38)[11]。2018-2020年我國不同省份PCV2的陽性率為53%(3619/6872),PCV2d占79%(49/62個樣本)[12]。巴西在1967年從病料中檢出了PCV3病毒,提示 PCV3多年來一直存在于豬群中[13]。2016年對安徽、重慶、福建、河南等 11 個省市的臨床樣品進行 PCV3檢測,結果豬場陽性率為 68.6%(24/35),個體陽性率為 34.7%(77/222)[14]。2018-2021年我國PCV3總陽性率為20.78%(2177/10478),190條PCV3全基因序列中,PCV3a占41.05%(78/190),PCV3b占20.53%(39/190),PCV3c占38.42(73/190)[15]。

PCV2可在淋巴系統內增殖引起機體免疫抑制,誘發其他病原繼發感染[16]。感染PCV2的豬可能會增加PRRSV的致病性[17]。PCV2和PCV3混合感染可導致母豬持續返情、屢配不孕進而引起繁殖障礙[18]。防控PCV2和PCV3感染最經濟有效的方式是免疫接種,PCV3暫時無成熟的疫苗,而近年來PCV2疫苗的免疫效果不佳,這可能與PCV2基因型間存在重組、PCV2與PCV3及其他疾病的混合感染有關。 本文評估了PCV2、PCV3在豬群中的合并感染情況,在大多數感染樣本中觀察到2～3種病毒病原體的混合感染?；贑ap基因分析了PCV2和PCV3的遺傳變異,揭示了2020-2021年我國部分地區PCV2和PCV3的分子流行趨勢及混合感染情況,為科學防控該病及疫苗研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 由武漢科前生物動物疫病診斷中心實驗室提供,1447個疑似豬圓環病毒感染的臨床樣本來自2020-2021年我國13個省(直轄市、自治區)的491個規?；i場,包括肺臟、精液、血液及胎兒胎衣等。

1.1.2 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒,南京中科拜爾醫學技術有限公司產品;瓊脂糖凝膠、DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒,北京天根生化科技有限公司產品;2×Phanta?Flash Master Mix(Dye Plus)、2×Animal Detection U+Probe Master Mix,南京諾維贊生物科技股份有限公司產品;DH5α、pMD19-T載體和DNA Marker DL 1 000,大連寶生物工程有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 低溫冰箱,海爾集團產品;組織研磨儀,上海凈信實業發展有限公司產品;臺式高速冷凍離心機和Mastercyclerep 384梯度PCR儀,Eppendorf公司產品;DYY-8C電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫療生物儀器股份有限公司產品;生物安全柜,北京東聯哈爾儀器制造有限公司產品;凝膠成像系統,美國ProteinSimple公司產品;熒光定量PCR儀器,Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 在PCV2和PCV3毒株中鑒定了病毒ORF2基因的保守區域,設計驗證了一組雙重熒光定量探針引物,并設計了PCV2和PCV3的ORF2基因測序引物,引物和探針由艾科瑞生物科技有限公司合成(表1)。

表1 檢測引物和ORF2基因擴增引物

1.2.2 病毒DNA的提取 按照病毒核酸提取試劑盒說明書操作步驟,提取病毒DNA,置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.3 樣品的熒光定量PCR(qPCR)檢測 試劑配制體系和反應條件如下:Mix 10μL、DNA模板2 μL、PCV2和PCV3上、下游引物及探針各0.5 μL,加ddH2O補齊至20 μL。反應條件為:37℃ 2 min;95℃ 30 s,95℃ 10 s,60℃退火采集熒光30 s,共45個循環。

1.2.4 ORF2基因片段的擴增、克隆與鑒定 隨機選取45家和47家豬場Ct值≤30的PCV2和PCV3陽性樣品,提取病毒DNA進行ORF2基因的PCR擴增,反應體系為25 μL:2×Phanta?Flash Master Mix (Dye Plus) 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板4 μL。反應條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物,回收目的片段。將回收產物與pMD19-T載體連接后轉化,選單個菌落接種于含100 mg/L Amp的LB液體培養基中,37℃、300 r/min振蕩培養12～16 h,提取質粒DNA,經PCR鑒定送往北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.5 序列的比對與分析 根據測序結果用MegAlign軟件對獲得的PCV2及PCV3的ORF2基因序列(表2)和GenBank中已公布的16條國內外有代表性的PCV2及PCV3的ORF2基因序列(表3)進行核苷酸及氨基酸同源性分析,并對Cap蛋白氨基酸進行多序列比對,用MEGA6軟件繪制分子遺傳進化樹。

表2 50株PCV2和PCV3 ORF2序列信息

表3 PCV2和PCV3參考毒株序列信息

2 結果

2.1 樣品的qPCR檢測結果

PCV2和PCV3在1447份樣品中陽性率分別為29.16%和18.93%,在規?；i場陽性率分別為47.05%和15.68%。用qPCR方法分別進行MhP、PRRSV、PR的病原檢測,從而了解其混合感染情況(圖1和表4)。在規?；i場中,PCV2和PCV3單一感染率分別為16.88%和7.79%,而PCV2和PCV3混合感染高達23.81%,PCV2與PCV3分別與PRRSV混合感染率分別為28.13%和23.37%,PCV2和PCV3、PCV2和PRRSV以及PCV3和PRRSV的混合感染率均高于PCV2和PCV3的單一感染,且存在與PRV、Mh等病原體2～4種不同程度的混合感染情況,表明2020-2021年我國規?；i場中PCV2和PCV3混合感染率較高,且存在PCV2和PCV3多種病原體混合感染的復雜情況。

圖1 不同病原體混合感染情況

2.2 ORF2基因PCR擴增鑒定結果

用測序引物PCV2-F1/R1和PCV3-F2/R2對部分陽性樣本質粒DNA進行PCR擴增鑒定,分別獲得大小約為958 bp和645 bp的目的條帶(圖2),與預期結果相符。

2.3 ORF2基因核苷酸與氨基酸同源性比對結果

用MegAlign軟件對測序獲取的PCV2和PCV3的ORF2基因核苷酸序列與各自對應的16個參考毒株的ORF2核苷酸和Cap蛋白氨基酸進行同源性比對,發現50個PCV2序列與參考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為75.6%～100%和83.1%～99.1%。50個PCV3序列與參考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為95.9%～100%和96.3%～100%(表5)。

表5 PCV2和PCV3測序毒株ORF2的核苷酸與氨基酸同源性

2.4 ORF2基因分子遺傳進化分析結果

對測序得到的PCV2和PCV3的ORF2基因核苷酸序列進行分子遺傳進化分析(圖3～圖4),得出PCV2d占80%(40/50),PCV2a占4%(2/50),PCV2b占16%(8/50),未檢測到PCV2c和PCV2e。PCV3a、PCV3b和PCV3c分別占28%(14/50)、22%(11/50)和50%(25/50),表明2020-2021年我國部分地區PCV2的主要流行基因型是PCV2d,其次為PCV2a和PCV2b。PCV3在我國部分地區的主要流行基因型為PCV3c,而PCV3a和PCV3b流行率也依然較高。

▲、■、◆、●、◇、△、○、□標記為PCV2a～PCV2h基因型參考序列

▲ PCV3a;■ PCV3b;● PCV3c

2.5 ORF2基因表達的Cap蛋白氨基酸多序列比對分析結果

以PCV2毒株CN/BDH/2010,GenBank(no.HM038017.1)為參考序列,對部分PCV2毒株的ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸序列進行比對分析(圖5),圖5中方框位置為蛋白表位。I53、K59、R63、N68、L89、T90、T121、N134、R/G169、D210、I215是PCV2d的特異性突變位點,可根據基因測序結果區分PCV2d和PCV2b,能為PCV2的分子分析提供理論基礎。Cap蛋白氨基酸主要變異位點為53-91、121-136、169-215氨基酸位點,此外還存在一些分散的突變位點,如R8Y、V30L、T121S,R169S/A、D210E/A等。以PCV3毒株US/MO2015,GenBank(no.KX778720.1)為參考序列,對部分PCV3毒株ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸序列進行變異位點比較,圖6中方框位置為蛋白表位,可以看出PCV3的Cap蛋白氨基酸共有8個突變位點,其中A24V、R27K、S77T是全球范圍PCV3公認的Cap蛋白氨基酸突變位點。根據Cap蛋白A24V和R2K兩個突變位點,可將50個PCV3毒株劃分為PCV3a(A24和R27)、PCV3b(A24和K27)和PCV3c(V24和K37),氨基酸高頻突變主要位于24、27、104和150位點。

圖5 PCV2 Cap蛋白氨基酸多序列比對

圖6 PCV3 Cap蛋白氨基酸多序列比對

3 討論

本研究結果顯示,2020-2021年我國規?；i場PCV2的樣本陽性率29.16%,PCV3的樣本陽性率為18.93%。PCV2和PCV3、PCV2和PRRSV以及PCV3和PRRSV的混合感染率均高于PCV2和PCV3的單一感染,且存在與PRV、Mh等病原體的混合感染,表明2020-2021年我國規?；i場中PCV2和PCV3混合感染率仍然較高,且存在PCV2和PCV3與多種病原體混合感染的復雜情況。本文分別隨機選取50份檢測到的PCV2和PCV3陽性樣品,對其ORF2基因全序列分析,發現PCV2d陽性率為80%,與前期研究中2012-2018年東南地區(67.6%)、豫南地區(76.92%)、華中地區(86.84%)和2018-2020年多省份地區(79%)接近,進一步證實了PCV2d基因型毒株已成為PCV2優勢流行毒株。PCV3c陽性率為50%,占比最高,其次為PCV3a和PCV3b。PCV3a為中部地區湖北、山西、安徽等省份的主要流行基因型,與之前的研究華中地區2013-2021年PCV3c占比50%(4/8)[15]相符。而PCV3b感染的省份中也覆蓋了PCV3a和PCV3c的感染分布區域,預示著PCV3的變異情況在我國規?；i場中普遍存在,且PCV3優勢基型已從PCV3a向PCV3c轉變。

本研究分析的樣本數量雖然相對較少,但樣本來源于我國養豬規模比較集約化的13個省份,其分子病原學的檢測結果仍可作為我國部分地區當前PCV2和PCV3流行的參考依據。在非洲豬瘟防控常態化的形勢下,加強PCV2疫苗免疫的同時,加強對疑似PCV感染豬進行分子病原學檢測及血清學監測是當下PCV防控和預警的有效手段。

對PCV2和PCV3的ORF2編碼的Cap蛋白氨基酸序列進行變異位點分析,發現PCV2的Cap蛋白氨基酸序列在53-91、121-136、169-215氨基酸位點幾個區域有較高的變異,同時存在一些分散的突變位點,如R8Y、V30L、T121S、R169S/A、D210E/A等,與前期研究報道吻合[19],表明Cap蛋白中的氨基酸突變可能與PCV2基因型多樣性的發生有關。PCV3的Cap蛋白氨基酸序列比對分析顯示多個毒株的氨基酸序列存在相似的突變現象,氨基酸高頻突變位于24、27、77和150位點,與近期研究結果一致[20]。通過比較發現PCV3的Cap蛋白氨基酸突變位點突變較少,且較為集中,主要位于1-30區域,而PCV2的Cap蛋白氨基酸突變位點多而分散。根據兩者的Cap蛋白氨基酸變異位點的特點,推斷PCV2基因型間的重組和突變的概率可能更大而快,PCV3則較小而慢。從氨基酸同源性上比較,推斷二者存在交叉免疫保護的概率較小或二者間的交叉保護力很低。不同毒株序列的氨基酸突變位點與毒力差異的相關性,PCV2與PCV3不同基因亞型之間是否存在基因重組有待進一步研究。

有研究表明,桿狀病毒表達的基于PCV2d的Cap蛋白可以誘導機體產生出比傳統病毒疫苗更高的體液免疫和細胞免疫水平。這種亞單位疫苗可以有效減少自然感染PCV2d的豬的病毒血癥[21]。目前預防PCV2病毒感染大多用PCV2b Cap蛋白疫苗,根據以往及2020-2021年我國部分地區PCV2和PCV3的分子流行病學研究結果,開發出特異性更好的PCV2d高效亞單位疫苗迫在眉睫,而PCV2d亞單位疫苗的研究思路也可以為PCV3疫苗的研發提供啟示和指導。