香葉醇通過調控Nrf2/HO-1途徑調節氧化應激減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷

羅 佳,吳 宇,劉京東,陳 莎,董 志

(重慶醫科大學藥學院,重慶市生物化學與分子藥理重點實驗室,重慶 400016)

近年來,中風造成了大量的死亡或致殘病例。在腦缺血的相關疾病中,缺血性腦卒中發病率最高,占腦卒中患病總數的60%～80%[1]。臨床上主要治療方法是及時對缺血腦組織進行再灌注,恢復正常血液循環。然而,恢復血液再灌注仍然不能緩解部分患者的癥狀,甚至會引起繼發性腦損傷,導致預后惡化。這一病理過程被定義為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)[2-3]。CIRI會誘發一系列細胞或者生化病理反應,包括細胞內活性氧(ROS)的產生、Ca2+超載、氧化應激、炎癥和細胞凋亡等[4]。這些病理反應最終會造成腦組織永久性損傷。因此,抑制上述病理反應是治療CIRI的關鍵。

氧化應激是CIRI中重要的病理過程之一。缺血/再灌注后腦組織中ROS產生過多會引起氧化應激[5]。核因子E2相關因子2 (Nrf2)是一種轉錄因子,也是氧化還原平衡的調節因子[6]。Nrf2激活誘導血紅素加氧酶- 1(HO-1)基因轉錄,減少氧化應激損傷,從而維持氧化還原平衡[7]。研究發現,通過激活Nrf2/HO-1信號通路可以抗氧化應激反應,對CIRI具有保護作用[8]。香葉醇(geraniol)屬于非環單萜醇類化合物,可從芳香植物揮發油中提取得到[9]。很多研究都表明香葉醇具有多種藥理作用,例如抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性[ 10]。但是目前關于香葉醇與CIRI中的Nrf2/HO-1途徑的關系尚未有研究。因此,本研究通過構建大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO/R)模型,觀察香葉醇對CIRI的潛在保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性SD大鼠,體質量(250～270)g。所有大鼠在25 ℃±2 ℃,相對濕度為60%～70%飼養,進行晝夜循環的光照。動物實驗通過重慶醫科大學動物倫理委員會的審查。

1.1.2藥物與試劑 香葉醇(純度99.98%,美國Sigma-Aldrich公司,W250708),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,美國Sigma-Aldrich公司,T8877),山羊抗兔二抗(中國Proteintech公司,SA00001-2),山羊抗鼠二抗(中國Proteintech公司,SA00001-1),β-actin一抗(中國Proteintech公司,81115-1-RR),Nrf2一抗(美國Affinity生物,AF0639),HO-1一抗(美國Affinity生物,AF5393),依達拉奉(美國Sigma-Aldrich公司,M70800),brusatol(美國Sigma-Aldrich公司,SML1868),線栓(中國佳靈生物公司),SOD試劑盒(中國碧云天公司,S0103)、GPx試劑盒(中國碧云天公司,S0056)、GSH試劑盒(中國碧云天公司,S0053)、MDA試劑盒(中國碧云天公司,S0131)

1.2 方法

1.2.1實驗分組、給藥及模型制備 1)為確定合適的香葉醇給藥劑量,我們將大鼠稱體質量編號后,采用完全隨機分組法,將大鼠隨機分為7組進行后續實驗：假手術組(sham)、假手術+200 mg·kg-1香葉醇組、缺血/再灌注(I/R)組、I/R+50 mg·kg-1香葉醇組、I/R+100 mg·kg-1香葉醇組、I/R +200 mg·kg-1香葉醇組、依達拉奉陽性對照組(3 mg·kg-1,靜脈注射)。大鼠在MCAO術前5 d連續腹腔注射香葉醇,術后再次腹腔注射香葉醇。根據前面實驗的結果,選擇最合適的香葉醇給藥劑量進行接下來的實驗。將大鼠隨機分為假手術組(sham)、缺血/再灌注模型(I/R)組、I/R+200 mg·kg-1香葉醇組、I/R+ brusatol(Nrf2抑制劑)組、I/R+200 mg·kg-1香葉醇+ brusatol組。MCAO術前1.5 h側腦室注射brusatol。假手術組只分離血管不插栓線,其余組別采用線栓法建大鼠CIRI模型。

2)4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定大鼠。消毒備皮后沿著頸部中線小心劃開皮膚,分離并結扎頸總動脈,頸外動脈和頸內動脈,注意避免損傷神經和氣管。在頸總動脈處用血管剪剪一個“V”字小口,將線栓輕輕從切口處插入,緩慢插入中動脈至18.5±1.0 mm深,然后將線栓固定。缺血1.5 h后,取出線栓實現恢復血液再灌注,結扎血管,縫合傷口,消毒。假手術組只分離血管但不插栓線。術后大鼠放回籠子中,給予食物和水。

1.2.2神經行為學評分 造模24 h后,采用隨機雙盲法,根據改良神經功能評分表評定大鼠神經功能受損情況。0分表示神經功能正常;1分表示輕度的神經功能損傷(提尾時左前肢屈曲);2分表示中度的神經功能損傷(行走時向左側轉圈);3分同樣表示中度神經功能損傷(向左側傾斜);4分表示無自發行走,意識減退;5分表示與缺血有關的死亡。

1.2.3TTC染色法測定大鼠腦梗死體積 造模24 h后,麻醉大鼠后迅速分離腦組織。隨后將腦組織放入-20℃冰箱中冷凍2 h,冠狀位依次切下腦片,大約2 mm每片。加入2%TTC溶液染色15 min。染色期間保持避光。然后加入4%多聚甲醛浸泡,固定過夜。第2天將腦片按順序放在黑色背景布上拍照。使用ImageJ軟件計算每張腦片的梗死體積。

1.2.4HE染色 造模24 h后,麻醉大鼠,然后從左心尖緩慢灌注含有肝素的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)以及4%多聚甲醛進行固定。固定好之后取出腦組織,加入4%多聚甲醛浸泡固定,放在4 ℃冰箱中保存。最后進行梯度脫水,石蠟包埋。切片進行HE染色。

1.2.5TUNEL染色測定大鼠皮層細胞凋亡 TUNEL染色法檢測大鼠右側受損皮質細胞凋亡情況。顯微鏡下觀察記錄切片染色情況。正常細胞核被染色為藍色熒光,而凋亡細胞則被染色為綠色熒光。通過ImageJ軟件,導入圖片后調整閾值,去除背景,選中細胞核,再選擇自動分析、計數顆粒,通過不同的情況設置參數,最后得出細胞數。分別計算皮層半暗區凋亡細胞數,細胞總數,再進行相比得出凋亡率。

1.2.6氧化應激參數測定 SOD、GPx、GSH和MDA的變化可以反應機體氧化應激程度,根據試劑盒說明書進行操作。

1.2.7免疫組織化學染色 用PBS清洗石蠟切片,加入0.3% H2O2室溫孵育5 min,加入5%的正常山羊血清室溫孵育10 min。再加入一抗,4 ℃過夜孵育。然后,加入二抗,37 ℃孵育10～30 min。再加入顯色劑顯色3～15 min,然后進行復染,脫水,透明,封片處理。顯微鏡下觀察切片并拍照記錄。

1.2.8Western blot檢測大缺血皮層組織中相關蛋白表達 造模24 h后麻醉大鼠,分離出腦右側皮層組織并置于-80 ℃冰箱保存。稱取30 mg左右組織,加入組織裂解液進行勻漿離心,并提取上清,加入buffer煮15 min,冷卻后冷凍保存。制膠后加入Marker和蛋白樣品,進行凝膠電泳、轉膜。轉膜結束后,將條帶轉移至含有5%脫脂奶粉的孵育盒中,室溫封閉1 h,封閉結束后用TBST洗膜3次,每次10 min,隨后分別加入Nrf2、HO-1和β-Actin,4 ℃過夜,加入二抗,37 ℃孵育1 h。用TBST洗膜3次,三抗室溫孵育30 min,用TBST洗膜3次。隨后將條帶用ECL超敏顯影液進行顯影、拍照。使用ImageJ軟件計算統計。

2 結果

2.1 香葉醇對腦缺血/再灌注后神經功能損傷和腦梗死的影響如Fig 1A,CIRI 24 h后,I/R組神經行為評分高于假手術組。香葉醇和依達拉奉組改善了大鼠的神經功能。如Fig 1B-C,TTC結果顯示,與假手術組相比,模型組出現白色梗死區域;與I/R組相比,I/R+香葉醇組腦梗死體積明顯減小,且呈劑量相關性。這些結果表明,香葉醇對I/R引起的腦損傷具有神經保護作用。在后續實驗中我們選擇了200 mg·kg-1作為最終給藥濃度。

Fig 1 Differences in neurological scores and cerebral infarct volume after cerebral

2.2 香葉醇對腦缺血/再灌注后大鼠受損皮層組織病理學的影響Fig 2 HE染色結果表明,與假手術組比較,I/R組右側皮質神經細胞出現明顯萎縮、斷裂,腦組織切片損傷嚴重。而I/R+香葉醇組受損神經細胞數量明顯減少,腦損傷明顯減輕。

Fig 2 Injury of right damaged cortex in rats after cerebral ischemia-reperfusion

2.3 香葉醇改善腦缺血/再灌注所致的細胞凋亡和氧化應激TUNEL染色使得凋亡細胞呈現綠色。由Fig 3A-B可見,與假手術組相比,模型組中綠色染色細胞數量增多,大量細胞發生了凋亡;與模型組比較,香葉醇組中綠色染色細胞數量明顯減少,細胞發生凋亡情況減少。SOD、GPx和GSH是體內重要的內源性抗氧化酶,MDA是脂質過氧化的產物,這些指標通產用于評估氧化應激的程度。由Fig 3C-F可見,與假手術組相比,模型組中SOD表達量、GSH表達量和GPx的表達量都呈現下調趨勢,而MDA表達量水平升高。相比于模型組,香葉醇干預組SOD、GSH和GPx的表達水平明顯上調,MDA的水平則明顯降低。以上結果表明香葉醇能夠減輕腦缺血再注損傷中氧化應激水平。

Fig 3 Changes in apoptosis and oxidative stress indicators after cerebral

2.4 香葉醇對腦缺血/再灌注后大鼠受損皮層Nrf2、HO-1蛋白表達的影響Fig 4免疫組化染色結果顯示,假手術組中無明顯染色顆粒,而模型組中棕色染色顆粒明顯,這表明經過造模后,Nrf2以及HO-1蛋白的表達水平會被誘導上調。同時與模型組相比,經過香葉醇干預后Nrf2及HO-1的蛋白表達明顯升高。

與免疫組化結果一致,Western blot實驗結果顯示,假手術組中Nrf2及HO-1蛋白表達水平較低,而在模型組中表達水平升高。與模型組相比,香葉醇給藥組中Nrf2及HO-1蛋白表達更高(Fig 4)。

Fig 4 Changes in Nrf2 and HO-1 protein expression in the injured cortex after cerebral

2.5 香葉醇聯合Nrf2抑制劑brusatol對腦缺血/再灌注后大鼠神經功能受損和腦梗死體積的影響與模型組相比,模型+brusatol組腦梗死體積更為明顯,神經功能受損情況加重,表明通過抑制Nrf2/HO-1信號通路會加重CIRI。與模型+香葉醇給藥組相比,模型+香葉醇+brusatol組腦梗死體積明顯有所增加,神經功能受損情況也較為明顯,說明抑制劑brusatol可以逆轉香葉醇對大鼠的腦保護作用。以上結果表明,香葉醇對CIRI保護作用可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路(Fig 5)。

Fig 5 Effect of geraniol combined with Nrf2 inhibitor brusatol on neurological function and TTC

2.6 香葉醇聯合Nrf2抑制劑brusatol對腦缺血/再灌注后大鼠受損皮層組織病理學的影響Fig 6 HE染色結果表明,與模型組對比,模型+brusatol組細胞病理學損傷更嚴重,視野中正常細胞核明顯更少,核固縮深染,周圍組織空泡化;與香葉醇給藥組相比,模型+香葉醇+brusatol組的核固縮程度較為嚴重,死亡細胞數較多。表明,香葉醇的神經保護作用能被Nrf2/HO-1抑制劑brusatol影響,并降低其保護作用。

Fig 6 Effect of geraniol combined with Nrf2 inhibitor brusatol on histopathologyof damaged cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats

2.7 香葉醇聯合Nrf2抑制劑brusatol對腦缺血/再灌注后氧化應激水平的影響由Fig 7所示,與模型組相比,模型+brusato組SOD、GSH和GPx的活性明顯下降,MDA 的水平明顯升高,相比于香葉醇給藥組,模型+香葉醇+brusatol組SOD、GSH和GPx的活性下降,MDA的水平升高。表明香葉醇的抗氧化應激作用能被Nrf2/HO-1抑制劑brusatol影響。

Fig 7 Effect of geraniol combined with Nrf2 inhibitor brusatol on oxidative stress parameters after cerebral

2.8 香葉醇聯合Nrf2抑制劑brusatol對腦缺血/再灌注后Nrf2、HO-1的蛋白表達影響由Fig 8所示,與模型組相比,模型+brusatol組Nrf2及HO-1的表達不明顯,相比于香葉醇給藥組,模型+香葉醇+brusatol組Nrf2及HO-1的表達有所降低,表明香葉醇對CIRI的保護作用是通過Nrf2/HO-1通路產生的。

Fig 8 Effect of geraniol combined with Nrf2 inhibitor brusatol on Nrf2 and HO-1 protein expression after

3 討論

大腦內動脈栓塞引起的缺血性腦卒中約占所有腦卒中的60%～80%,在全球范圍內,已成為導致死亡和殘疾的主要原因之一[11]。目前,急性缺血腦卒中患者最常用的治療方法是溶栓治療。然而,血液供應的恢復可進一步加重缺血/再灌注損傷所致的腦組織損傷[12]。CIRI涉及一系列的病理生理損傷機制,包括興奮毒性、氧化應激、炎癥和細胞凋亡。尋找有效治療缺血性腦卒中的方法與藥物仍然是臨床研究的一大挑戰。香葉醇在以往的研究中發現具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化應激等作用,既往研究也表明香葉醇對CIRI有保護作用[13],但具體機制尚不明確。在本研究中,我們通過建立了大鼠CIRI模型,并給予香葉醇藥物干預。通過神經功能評分、TTC染色測定腦梗死體積以及HE染色觀察受損皮層病理損傷情況,以上結果表明,香葉醇能夠明顯改善大鼠神經功能,減少腦梗死,改善右側皮質病理損傷。

CIRI會誘發氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等病理過程。其中,細胞凋亡是神經細胞死亡的重要方式之一,越來越多的研究表明,減少細胞凋亡的發生可以減輕CIRI[14]。在本研究中,我們通過TUNEL染色發現,與模型組相比,經過香葉醇處理之后,能有效抑制細胞凋亡的發生。這說明香葉醇可以緩解CIRI后神經元的死亡,發揮保護作用。

氧化應激被定義為一種病理狀態,與各種疾病的衰老和病理過程有關,包括動脈粥樣硬化、高血壓、中風和神經退行性疾病。氧化應激或氧化還原失衡可導致脂質和蛋白質的過氧化,以及DNA損傷,從而在體內產生毒性作用[15]。當發生氧化應激時,活性氧或活性氮超負荷或超過機體的清除能力,會導致機體氧化還原系統失衡。缺血/再灌注損傷會誘發氧化應激反應,因此氧化應激也是CIRI過程中重要的病理生理機制[16]。Nrf2是抗氧化反應的主要調節因子,能夠通過協調基礎和應激誘導的多種細胞保護基因的激活來發揮保護作用。氧化應激可以激活Nrf2實現自我保護。HO-1是一種限速酶。在氧化應激條件下,Nrf2被磷酸化并易位到細胞核,并啟動HO-1基因的轉錄。有研究發現,Nrf2/HO-1途徑在CIRI中起著重要作用,能夠抑制氧化應激的發生[17-18]。本研究通過測定Nrf2和HO-1蛋白的表達,結果發現,模型組中Nrf2和HO-1蛋白表達水平呈現上升的趨勢,而香葉醇給藥之后能夠明顯增加Nrf2和HO-1蛋白表達水平。在加入Nrf2抑制劑brusatol之后,能夠逆轉香葉醇對CIRI的神經保護作用,以上結果均能說明香葉醇能夠通過激活Nrf2/HO-1信號通路調節氧化應激,從而減輕大鼠CIRI。

4 結論

綜上所述,香葉醇對CIRI具有神經保護作用。香葉醇可以減少CIRI后氧化應激的發生以及減輕細胞凋亡,其保護機制可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路實現。我們的研究結果豐富了香葉醇對CIRI神經保護作用的分子機制,為腦卒中治療提供了有希望的藥物靶點。