miR-141-5p/ZNF705A對慢性粒細胞白血病細胞源外泌體調控骨髓間充質干細胞黏附作用的機制

鮑 靜,許 晗,汪萬杰,許婷婷,戴霽菲,夏瑞祥

(安徽醫科大學第一附屬醫院血液科,安徽 合肥 230032)

慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種獲得性血液系統惡性腫瘤,主要來源于骨髓造血干細胞的惡性增殖,約占新診斷成人白血病的15%[1]。隨著CML發病機制的不斷闡明,以酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)為代表的分子靶向治療已成為CML的治療首選。然而,研究發現仍有15%～25%的CML慢性期患者對TKIs耐藥,加速期及急變期CML患者耐藥率更高[2]。骨髓微環境是一種可以在空間意義上為造血干細胞提供庇護的復雜網狀結構,其組成成分除造血干細胞外,還包括骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪干細胞、成骨細胞、內皮細胞、成纖維細胞等非造血細胞和細胞外基質,以及多種細胞因子。在這些非造血細胞成分中,BMSCs占據主導地位,在骨髓微環境的黏附功能中發揮主要作用,能夠促進造血干細胞的歸巢和造血功能。嚴重的造血功能失調將會導致各種血液疾病,如再生障礙性貧血、CML等骨髓增生性疾病的發生[3]。然而,BMSCs在CML中的作用及機制仍未完全明確。

微小RNA(microRNA,miRNA)是由19～25個核苷酸組成的進化上保守的單鏈非編碼RNA分子,在轉錄后水平調控基因的表達,參與腫瘤的發生發展。miRNA既可以作為癌基因促進癌癥進展,也可以作為腫瘤抑制因子阻礙癌癥進展[4-5]。目前,對參與CML中骨髓微環境黏附功能的miRNA仍知之甚少。

外泌體(exosome,Exo)是一類直徑為30～120 nm的小的細胞來源囊泡,通過攜帶蛋白質、脂質、mRNA、miRNA、lncRNA或circRNA,參與細胞間通訊[6]。有研究揭示了CML細胞源Exo經miRNA調控BMSCs的黏附功能,在CML的發生發展中發揮重要作用[7]。課題組前期研究發現[8],miR-141-5p可能在CML中發揮抑癌基因的作用。本實驗擬闡明miR-141-5p修飾的CML源性Exo對BMSCs黏附功能的影響及其調控機制,為CML治療提供新的分子靶點。

1 材料

1.1 臨床樣本收集2021年1月-2021年12月安徽醫科大學第一附屬醫院血液科病房和門診初診CML慢性期患者及健康人外周血標本,各20例,用于分離Exo;骨髓樣本用于分離獲得BMSCs。另外,收集健康志愿者臍帶血,用于分離獲得人臍血單個核細胞(human umbilical cord blood-mononuclear cells,HUCBMNCs)。參與本研究者均已簽署書面知情同意書,本研究方案已獲得安徽醫科大學生物倫理委員會批準(No. 20200040)。

1.2 細胞株人慢性髓系白血病細胞株K562、人胚腎細胞株293T,均購自江蘇無錫懷信生物。

1.3 主要試劑TRIzol、BCA蛋白定量試劑盒、RPMI 1640,均購自Biosharp公司;CD34+細胞分選試劑盒(貨號：130-046-702),購自德國Miltenyi公司;Percoll分離液,購自北京索萊寶生物科技有限公司;無Exo胎牛血清(貨號：C3801-0050),購自北京博邁德基因技術有限公司;Exo提取試劑盒(貨號：KGPE001-10),購自南京凱基生物科技發展有限公司;Lipofectamine 2000(貨號：11668-027),購自美國Invitrogen公司;雙熒光檢測試劑盒(貨號：E1910),購自美國Promega公司;CCK-8試劑盒,購自日本同仁化學研究所;Annexin V-FITC/PI試劑盒(貨號：KCD-T1004),購自上?？苿撨_生物醫藥科技有限公司;一抗β-actin(貨號：81115-1-RR)、Alix(貨號：12422-1-AP)、CD63(貨號：25682-1-AP)、CD29(貨號：12594-1-AP)、CD45(貨號：60287-1-Ig)、CD90(貨號：27770-1-AP)、CD31(貨號：11265-1-AP)、CD34(貨號：14486-1-AP)、CD44(貨號：15675-1-AP)、CXCL-12(貨號：17402-1-AP),均購自武漢三鷹生物公司;一抗ZNF705A(貨號：Y3715),購自美國lmmunoway公司。

1.4 儀器Microfuge 20R離心機(美國貝克曼公司);CYTATION 5全自動活細胞成像微孔板檢測系統(美國BioTek公司);Axio Vert A1熒光倒置顯微鏡(德國Carl zeiss公司);Bioshine ChemiQ化學發光凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司);HITACHI HT7700電子顯微鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1 BMSCs與HUCBMNCs的分離培養采用Ficoll分離方法分離骨髓中的單個核細胞,使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養基重新懸浮細胞,調整細胞密度為5×108·L-1,然后將細胞接種于細胞培養瓶中進行原代培養,細胞在CO2濃度為5%,溫度37 ℃的培養箱中生長。采用密度梯度離心法提取HUCBMNCs,以合適的濃度接種于細胞培養板中進行培養。

2.2 透射電鏡鑒定Exo對收集的外周血血清與細胞培養上清液離心,除去細胞碎片等雜質。0.22 μm的濾膜過濾獲得的上清液,然后超高速100 000×g離心1 h,棄上清。使用PBS緩沖液重新懸浮離心后的沉淀,再次離心,棄上清即獲得Exo。將獲得的Exo使用PBS重新懸浮后,保存于-80 ℃備用。將Exo點樣到經formvar包被的copper grid(200目)上,2%多聚甲醛固定10 min,然后在無菌蒸餾水中洗滌,隨后2%乙酸鈾酰對比劑處理copper grid 15 min。在樣品上滴加1滴0.13%的甲基纖維素與0.4%乙酸鈾酰包埋樣品,使用電子顯微鏡于80 kV條件下檢測grid,并拍攝圖片。

2.3 細胞轉染取對數生長期的K562細胞或BMSCs,以1×108·L-1的密度分別接種至6孔板,每孔2 mL,每個濃度梯度3個復孔。利用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染mimic NC、miR-141-5p mimic、inhibitor NC、miR-141-5p inhibitor,轉染48 h后,細胞或上清用于后續實驗。

2.4 CCK-8法檢測細胞活性使用不同轉染后K562細胞Exo處理BMSCs,分別在0、24、48、72 h時,于每孔中加入15 μL的CCK-8溶液,37 ℃、5% CO2培養箱中繼續孵育2 h;酶標儀450 nm波長檢測同一時間點吸光度(absorbance,A)值。

2.5 PKH67熒光染料標記CD34+與K562細胞Exo使用PKH67熒光染料標記Exo,觀察BMSCs對Exo的攝取情況。吸取4 μL A液至1 mL稀釋液C中制備染色工作液,混勻。提取的K562細胞Exo經PBS清洗后吸棄上清,加入1 mL稀釋液C,輕輕重懸Exo,立即混勻,反應1～5 min。加入10 mL完全培養基終止染色,100 000 ×g離心1 h,吸棄上清,PBS清洗3遍,用5 mL完全培養基重懸清洗后的Exo,加入至對數生長期的BMSCs中繼續培養。24 h后,棄上清,PBS洗滌細胞2次,DAPI復染細胞核,共聚焦熒光顯微鏡下觀察,并保存圖像。

2.6 螢光素酶實驗檢測miR-141-5p與ZNFs結合情況取對數生長期的293T細胞,調整細胞密度為5×107·L-1,接種至48孔細胞培養板,每孔300 μL,每個濃度梯度3個復孔。利用Lipofectamine 2000分別轉染pmirGLO-ZNFs、miR-141-5p mimic,48 h后進行雙螢光素酶檢測。

2.7 qRT-PCR檢測采用TRIzol試劑提取CML患者血清、細胞或骨髓組織的總RNA,使用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq II進行qRT-PCR。所有操作嚴格按照試劑盒說明書執行。引物信息見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers

2.8 Western blot檢測將細胞置于RIPA裂解緩沖液中充分裂解,于4 ℃、12 000 r·min-1將刮棒刮取的細胞離心5 min得到細胞總蛋白。使用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度,將蛋白樣品煮沸10 min后,在SDS-PAGE凝膠上分離。轉移至PVDF膜上,使用脫脂牛奶常溫封閉1 h,加入一抗,4 ℃條件下與PVDF膜孵育過夜。次日,加入二抗與PVDF膜在室溫下孵育1 h,ECL顯影。

2.9 細胞黏附實驗將BMSCs以1×105·L-1密度接種于培養皿中,至近60%融合時,加入Exo,48 h后進行黏附實驗。分別取上述分離的HUCBMNCs,接種于上述BMSCs培養皿中,孵育2 h。PBS洗3次,洗去未黏附的細胞。結晶紫染色10 min、乙酸溶解,酶標儀測定A值。

3 結果

3.1 miR-141-5p在CML患者外周血Exo中低表達收集健康人與CML患者外周血,并分離Exo,經透射電鏡和NTA分析發現,分離的Exo大小為150 nm左右(Fig 1A)。qRT-PCR結果顯示,CML-Exo組Exo中miR-141-5p的含量與Normal-Exo組相比明顯降低(Fig 1B)。Western blot結果表明,分離的樣本表達Alix和CD63蛋白,證明為Exo(Fig 1C)。

Fig 1 Expression of miR-141-5p in Exo in clinical n=3)

3.2 K562細胞分泌的Exo鑒定及miR-141-5p在Exo中表達情況進一步收集K562細胞與健康人外周血CD34+細胞分泌的Exo,電鏡檢測及NTA粒徑分析顯示,分離的Exo大小為150 nm左右(Fig 2A)。qRT-PCR結果顯示,K562-Exo中的miR-141-5p表達明顯降低(Fig 2B)。Western blot結果顯示,分離的樣本表達Alix和CD63蛋白,證明為Exo(Fig 2C)。

Fig 2 Expression of miR-141-5p in n=3)

3.3 BMSCs分離、培養及Exo被BMSCs吞噬情況鑒定通過分離HUCBMNCs并誘導成BMSCs,Western blot結果顯示表達CD29和CD90蛋白,不表達CD45、CD31和CD34蛋白,提示獲得的是BMSCs(Fig 3A)。進一步qRT-PCR和Western blot結果顯示,CML-BMSCs中CD44和CXCL12的表達明顯降低(Fig 3B、3C),提示CML患者BMSCs的黏附功能降低。為了驗證Exo是否被BMSCs吞噬,使用PKH67熒光染料標記CD34+與K562細胞Exo,發現Exo可被BMSCs吞噬(Fig 3D)。

Fig 3 Exo could be phagocytosed by n=3)

3.4 K562細胞源Exo能夠降低CD34+細胞源Exo誘導BMSCs的黏附功能為了進一步探究K562細胞源Exo對BMSCs的黏附作用,將K562細胞和CD34+細胞分泌的Exo分別與BMSCs共培養。Western blot和qRT-PCR結果顯示,BMSCs與CD34+細胞分泌的Exo共培養后,BMSCs中的黏附蛋白CD44和CXCL12的表達明顯增高,且K562-Exo組能夠降低CD34+-Exo組中黏附蛋白的表達(Fig 4A、4B)。CCK-8檢測結果發現,Exo同樣能夠促進BMSCs活性,且CD34+-Exo組比K562-Exo組作用更明顯(Fig 4C)。進一步黏附實驗發現,Exo能夠促進BMSCs的黏附,但K562-Exo組能夠降低CD34+-Exo組中BMSCs的黏附能力(Fig 4D)。以上結果說明,K562細胞源Exo促進BMSCs的活性和黏附作用,但較CD34+-Exo組明顯降低,提示K562細胞源Exo可能參與CML患者的骨髓造血功能。

Fig 4 Exo derived from K562 enhanced adhesion of n=3)

3.5 miR-141-5p與ZNF705A靶向結合使用TargetScan數據庫發現,miR-141-5p與ZNF705A mRNA結合。進一步雙螢光素酶結果顯示,miR-141-5p可與ZNF705A的3′-UTR區域結合(Tab 2、Fig 5A)。Western blot和qRT-PCR結果表明,使用miR-141-5p mimic過表達BMSCs中miR-141-5p的表達可降低ZNF705A的mRNA和蛋白表達;miR-141-5p inhibitor抑制miR-141-5p的表達能夠升高ZNF705A的mRNA和蛋白表達(Fig 5B、5C)。提示K562細胞源Exo中miR-141-5p通過調控BMSCs中ZNF705A的表達,參與BMSCs的黏附能力。

Tab 2 Paired genes displayed in results of dual luciferase

Fig 5 miR-141-5p targeted binding to n=3)

3.6 K562細胞源Exo通過miR-141-5p/ZNF705A調節BMSCs的黏附功能首先,采用PKH67熒光染料標記K562細胞源Exo,與BMSCs共培養,結果顯示Exo被BMSCs吞噬(Fig 6A、6B)。qRT-PCR和Western blot結果顯示,miR-141-5p mimic能夠使K562細胞源Exo中miR-141-5p過表達,抑制BMSCs中ZNF705A的表達;miR-141-5p inhibitor能夠抑制K562細胞源Exo中miR-141-5p的表達,促進BMSCs中ZNF705A的表達(Fig 6C、6E)。同時,miR-141-5p mimic促進黏附因子CD44和CXCL12的表達,而miR-141-5p inhibitor抑制其表達(Fig 6D、6E)。CCK-8實驗結果顯示,miR-141-5p mimic促進BMSCs活性,miR-141-5p inhibitor可抑制其活性(Fig 6F)。黏附實驗證實,miR-141-5p mimic能夠促進BMSCs的黏附功能,miR-141-5p inhibitor則抑制其黏附功能(Fig 6G)。進一步通過ZNF705A-siRNA沉默BMSCs中ZNF705A的表達,發現能夠促進黏附因子CD44和CXCL12的表達(Fig 6H、6I)、BMSCs活性(Fig 6J)和黏附功能(Fig 6K)。提示可通過上調CML細胞源Exo中miR-141-5p水平,靶向抑制BMSCs中ZNF705A基因,進而促進BMSCs的活性和黏附功能。

Fig 6 Targeted regulation of ZNF705A by modulating level of miR-141-5p in CML exosomescould regulate adhesion function of n=3)

4 討論

在骨髓微環境中,BMSCs作為非造血細胞的前體細胞,在造血干細胞的黏附、固定中發揮重要位點的作用[9]。有研究表明,減少CML患者的骨髓微環境中黏附分子CXCL12的表達,導致CML干細胞歸巢和滯留的降低[10],揭示了造血干細胞在骨髓微環境中受到的歸巢及黏附作用降低可能導致CML髓外浸潤及骨髓移植治療失敗,改善這一現象可為治療CML提供可能的新手段。

早期Exo被認為是細胞的“垃圾袋”以除去多余成分,然而,越來越多的研究表明,Exo參與微環境細胞與細胞之間的交流對話,在調節生理與病理過程中發揮重要作用。例如免疫細胞來源的Exo在介導細胞間通訊的同時,還可以參與機體免疫應答的調控,而來源于腫瘤細胞的Exo在腫瘤的發生、進展乃至致癌基因的轉移過程中均發揮重要作用[11]。在既往的研究中發現,急性髓系白血病患者的血清中含有更高水平的Exo,其可以通過對免疫抑制細胞產生積極影響或對免疫細胞產生抑制作用,從而在癌癥發展過程中起到關鍵作用。而在慢性淋巴細胞白血病中,Exo可以分泌一些白血病生長因子如IL-6、CCL2,以及與腫瘤進展相關S100-A9蛋白等,可促進疾病的進展。同樣,Exo在血液系統惡性腫瘤中作為血管生成和轉移介質的作用已被廣泛研究,其被發現可以直接作用于血管內皮細胞,調節新生血管過程。除此以外,Exo還被發現可誘導血管生成,從而導致白血病進展,例如外泌體CLIC1可以通過調節ITGβ1-MAPK/ERK軸,促進HUVEC血管生成,從而加速轉移和血管生成[12]。簡而言之,白血病細胞來源的Exo含有促血管生成分子,通過血管生成,導致白血病細胞增殖和轉移到遠處組織。因此,Exo在白血病的發生、發展及轉移等過程中均發揮著不可或缺的作用[13]。本文分別收集K562細胞、CML患者和健康人外周血細胞源Exo,與BMSCs共培養,結果顯示,Exo可促進BMSCs活性和黏附能力;但與CD34+細胞源Exo組相比,K562細胞源Exo促進BMSCs活性和黏附能力的作用不夠明顯。Western blot和qRT-PCR分別檢測細胞源Exo中miR-141-5p的表達水平,發現與健康對照相比,CML患者和K562細胞源Exo中miR-141-5p的表達明顯降低,上調CML K562細胞源Exo中miR-141-5p的水平,可明顯促進BMSCs的活性和黏附能力,下調miR-141-5p的表達,則會抑制BMSCs的活性和黏附能力。提示miR-141-5p可能通過修飾CML細胞源Exo,影響BMSCs的活性和黏附功能。

有研究揭示鋅指蛋白可能通過調控腫瘤細胞黏附功能,參與疾病的發生發展[14-15],鋅指蛋白家族成員ZEB1和ZDHHC5參與了BMSCs的分化、衰老等[16-17],鋅指蛋白家族成員RNF6[18]等均參與了CML的發病。實驗前期通過生物信息學預測發現,miR-141-5p能夠與大量的鋅指蛋白基因3′-UTR區域結合,其中ZNF705A結合分數最高,雙螢光素酶基因報告實驗進一步驗證miR-141-5p與ZNF705A靶向結合,上調K562細胞源Exo中miR-141-5p水平,靶向抑制ZNF705A基因的表達,可增強BMSCs的黏附功能。以上均提示miRNA-141-5p修飾的CML細胞源Exo可能通過靶向調控下游的ZNF705A,參與BMSCs黏附功能的調節。

綜上,本研究初步揭示了CML細胞源Exo中miR-141-5p調控BMSCs黏附功能的作用機制,從而改善CML骨髓造血功能,為CML治療提供了新的有效的分子靶點與實驗依據。