富馬酸二甲酯抑制NLRP3/AIM2炎性小體防治脾臟組織輻射損傷

張亮亮,胡昌坤,吳澤坤,閆梓喬,廖澤彬,高 月

(1.廣東藥科大學藥學院,廣東 廣州 510006;2. 軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所,北京 100850;3.天津中醫藥大學藥學院,天津 301617;4.中國人民解放軍總醫院第六醫學中心中醫科,北京 100089)

隨著核能在軍事、醫學、工業等領域的廣泛應用,輻射不可避免的出現在人們生活中,成為一種潛在威脅。此外,作為治療惡性腫瘤的一種主要有效手段之一,放療具有適應性廣、治療簡便等特點。世界范圍內有39%～50%的癌癥患者通過放療對癌癥進行治療[1],但是放射治療是利用放射性同位素產生的α、β、γ射線和各類X射線治療機或加速器產生的X射線、電子線、質子束及其他粒子束等對腫瘤的一種局部治療方法。因此,放療的同時,也會不可避免的對機體造成損傷,從而降低放療患者的生活質量[2]。氨磷汀是目前FDA批準的唯一用于臨床的放射防護劑,但氨磷汀具有一定的毒副作用,易消化道功能紊亂、低血壓等癥狀[3]。因此,迫切需要尋找一種高效、低毒的輻射防護劑。

富馬酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是FDA自1994年以來批準用于治療復發-緩解性多發性硬化癥[4],具有多種生物活性,前期的研究已表明DMF具有抗炎[5]、抗氧化[6]、免疫調節[7],神經保護[8]及保護軟骨[9]的作用。但是DMF的輻射損傷防護作用目前尚未有報道,本研究使用60Co γ射線誘導小鼠輻射損傷,同時給予DMF干預,通過對脾臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18及NLRP3/AIM2炎性小體水平變化進行研究,探討DMF對輻射損傷的防護作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號：SCXK(京)2021-0006。所有實驗過程中對動物的處置嚴格遵守軍事醫學研究院實驗動物管理與使用委員會的倫理學標準進行(倫理號：IACUC-DWZX-2021-557)。將小鼠維持在22 ℃～25 ℃的12 h光照/黑暗周期中,確保其可獲得充足高壓滅菌的食物和水。

1.2 藥物與試劑DMF(批號：HY-17363, MCE公司)、Nigericin sodium salt(HY-100381,MCE公司)均購自MCE公司;Poly(dA ：dT)(批號： tlrl-patn)購自Invivogen公司;白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-18(IL-18)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、NLRP3、AIM2酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑均購于酶免生物技術有限公司;gamma H2A.X抗體(ab81299, Abcam);ASC(67824, CST);AIM2(20590-1-AP, proteintech);NLRP3(381207,成都正能生物技術有限公司)。

1.3 儀器60Co γ射線照射源由軍事醫學研究院輻射醫學研究所提供,單次吸收劑量率為70.37 cGy·min-1。將小鼠置于離照射源2.5 m處。酶標分析儀(Rayto RT-6100);熒光顯微鏡(Nikon Elipse C1)。

2 方法

2.1 動物分組與造模設空白對照組、輻射模型組、DMF(15 mg·kg-1)給藥組、Nigericin(10 mg·kg-1)+ DMF (15 mg·kg-1)給藥組、Poly(dA ：dT)(50 μg·kg-1)+ DMF (15 mg·kg-1)給藥組。每組12只,輻照前12 h,輻照后0.5、12、24、48 h分別腹腔注射DMF一次,Nigericin、Poly(dA ：dT)于輻照前12 h給藥一次,對照組小鼠在相同時間點注射同等體積注射用油;照射時將小鼠置于離沽源2.5 m處,照射時間=照射劑量/劑量率,本實驗照射所用時間為7.1 min;生存率實驗： 每組小鼠在照射后30 d(n=10)進行觀察和記錄。

2.2 脾臟病理學檢查取照射后第1、2、3天脾臟,置于4%多聚甲醛組織固定液中固定24 h。然后組織經乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切成厚度5 μm切片,烘干脫蠟并用蘇木精-伊紅染色后,光學顯微鏡下觀察各組脾臟之間病理學變化。

2.3 脾臟組織細胞凋亡檢測取石蠟切片,用二甲苯浸洗2次,再用梯度乙醇浸泡,PBS漂洗后用滴加不含DNase的蛋白酶K工作液(20 mg·L-1)處理30 min,再加入制備的TUNEL反應混合液于切片上,避光靜置60 min,終止反應液15 min,加入converterPOD滴于組織上,避光放置30 min,再滴加DAB顯色液于組織切片上,室溫反應10 min后用蘇木精復染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠進行封片,熒光顯微鏡下觀察各組脾臟細胞凋亡情況。

2.4 脾臟炎癥因子及炎性小體檢測照射結束后72 h,取出小鼠脾臟進行組織勻漿,3 000 r·min-1離心15 min,取上清液,嚴格按ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NLRP3及AIM2含量。于酶標儀450 nm波長處測定各組A值,并計算各指標濃度。

2.5 Western blot法檢測蛋白表達水平稱取50 mg照射后1 d脾臟組織,將其置于含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的0.5 mL RIPA裂解液中,使用組織勻漿機充分勻漿;隨后在渦旋震蕩儀上震蕩并在冰浴中裂解;裂解液于4 ℃預冷離心機中12 000g離心15 min,上清即為總蛋白提取液。再使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白定量,最后加入loading buffer,于金屬浴100 ℃加熱10 min變性后進行SDS PAGE蛋白電泳。電泳條件為：80 V電壓電泳2 h。電轉印條件為：300 mA,80 min。5%脫脂奶粉室溫孵2 h封閉PVDF膜,于4 ℃分別孵育一抗NLRP3抗體(1 ∶1 000)、ASC抗體(1 ∶1 000)、AIM2抗體(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)過夜,將PVDF膜清洗后,于室溫下孵育山羊抗兔抗體(1 ∶5 000),最后洗膜3次,配制ECL試劑化學發光液顯影,采用化學發光法顯影。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值來反映相關蛋白的表達水平,采用ImageJ軟件進行灰度值分析。

2.6 免疫組織化學染色脾臟組織切片經PBS清洗3次,滴加3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶室溫孵育10 min,胰蛋白酶進行組織抗原修復15 min,3% BSA封閉非特異性抗原室溫孵育20 min,棄血清后直接加一抗NLRP3和AIM2,4 ℃冰箱內孵育過夜。第2天37 ℃復溫30 min,PBS清洗后加二抗(山羊抗兔IgG)室溫孵育90 min,PBS 清洗后滴加 DAB 液顯色。蘇木精復染、常規脫水透明、中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察。表達NLRP3細胞為紅色、AIM2細胞為綠色,并使用軟件進行統計分析。

2.7 統計學分析使用 GraphPad Prism 9(GraphPad Software lnc.La Jolla, USA)進行統計分析,每個實驗重復3次,t檢驗統計得出是否具有統計學差異,其中P<0.05為統計學意義上的顯著差異。

3 結果

3.1 輻照后小鼠生存率及體質量變化為研究DMF對輻射損傷小鼠是否有保護作用,檢測了8 Gy輻射小鼠的生存時間。DMF在輻照前12 h給藥一次,輻照后0.5、12、24、48 h各給藥一次(Fig 1A)。對照組小鼠照射后14 d內全部死亡,給藥組小鼠30 d存活率為30%(Fig 1B)。輻照第4天給藥組小鼠體質量降至最低,隨后體質量開始回升并趨于穩定,而輻照組小鼠在照射后體質量一直處于下降狀態(Fig 1C)。

Fig 1 Dimethyl fumarate showed a significant radioprotective effect in

3.2 DMF可以改善小鼠脾臟病理狀況脾臟組織病理切片顯示：對照組小鼠脾臟實質紅髓、白髓,各層結構清晰,其中脾索和脾血竇分布均勻與白髓分界清楚。輻照組中大量白髓萎縮,體積減小,形態結構不規則,白髓中可見核固縮,細胞減少。與輻照組相比,給藥組小鼠脾臟淋巴細胞壞死有明顯下降,紅白髓分界相對清晰,未見明顯淤血(Fig 2A);并對白髓占比(Fig 2B)及平均白髓面積進行統計(Fig 2C)。這表明DMF能夠減輕輻射后小鼠脾臟組織的損傷。

Fig 2 DMF alleviated damage of spleen caused by

3.3 DMF可減輕小鼠脾臟細胞凋亡用TUNEL染色法檢測脾臟發生凋亡細胞數量,結果顯示對照組小鼠脾臟偶見凋亡細胞,輻照組小鼠脾臟凋亡細胞明顯增多,而給藥組小鼠相對于輻照組小鼠,凋亡細胞明顯減少(Fig 3A)。對三組凋亡細胞進行統計學分析(Fig 3B),結果具有顯著性。

Fig 3 DMF alleviated irradiation-induced apoptosis of spleen cells in

3.4 DMF可減輕輻照所致脾臟炎癥因子及炎性小體水平升高使用ELISA試劑盒檢測組織內炎癥因子及炎癥小體水平。結果顯示,相比于正常對照組,輻照組小鼠脾臟IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6、NLRP3和AIM2各有不同程度升高,在提前給予DMF處理后,相比于輻照組,給藥組均能不同程度調節輻照導致的組織內細胞因子紊亂,其中TNF-α (P<0.01, Fig 4A)、IL-1β (P<0.01, Fig 4B)、IL-6 (P<0.01, Fig 4C)、IL-18 (P<0.01, Fig 4D)、NLRP3 (P<0.05, Fig 4E)、AIM2 (Fig 4F)均有不同程度統計學意義,表明DMF能夠減輕輻照導致的小鼠炎癥反應。

Fig 4 The regulatory effect of DMF on expression of inflammatory cytokines in spleen of mice after ionizing

3.5 DMF減輕小鼠脾臟組織組織NLRP3/AIM2炎性小體表達Western blot結果顯示,輻照后NLRP3、AIM2等蛋白表達升高,而DMF給藥組NLRP3、AIM2表達水平降低(Fig 5A-B);組織熒光染色顯示,對照組僅見極少的NLRP3/AIM2陽性染色;與對照組相比,輻照組小鼠脾臟NLRP3/AIM2表達明顯增加;與輻照組相比,DMF給藥組組織內NLRP3/AIM2表達明顯減少(Fig 5C、5E),對各組平均熒光強度進行統計分析,差異具有統計學意義,見Fig 5D、5F。

Fig 5 DMF alleviated expression of NLRP3/AIM2 inflammasomes in spleen of

3.6 DMF的輻射保護作用依賴于NLRP3/AIM2炎癥小體使用NLRP3激動劑尼日利亞菌素鈉鹽和AIM2激動劑Poly(dA ：dT)檢測DMF對輻射后小鼠脾臟細胞防護作用,結果顯示,加入NLRP3激動劑和AIM2激動劑組的小鼠脾臟凋亡細胞相比于輻照組并未減少。與給藥DMF組相比,凋亡細胞明顯增多(Fig 6A、6C)。對各組TUNEL陽性細胞數進行統計,差異具有統計學意義,見Fig 6B、6D。

Fig 6 Effect of agonists on apoptosis of spleen cells after ionizing

4 討論

脾臟是機體最大的外周免疫器官,含有人體眾多的淋巴細胞,在免疫調節中發揮重要作用[10]。由于脾臟對輻射的高敏感性,機體受到電離輻射后,淋巴細胞在幾小時內就會死亡,從而影響機體正常造血功能和免疫功能[11]。本實驗研究發現,DMF照射前12 h給藥能顯著降低小鼠死亡率。同時,脾臟HE、TUNEL染色觀察發現,DMF可顯著增加輻照后第1、2、3天脾臟白髓含量,使脾臟病理結構損傷得到恢復,脾臟凋亡細胞顯著減少。這初步說明DMF對電離輻射導致的脾臟損傷具有保護作用。

研究表明,電離輻射可能會引起劑量依賴性的免疫反應損傷,以及持續的炎癥狀態和細胞因子失調[12]。此外,電離輻射也會導致血細胞大規模破壞,進而抑制免疫功能并增加感染風險[13]。除了免疫抑制之外,電離輻射還可以誘導促炎細胞因子的釋放,使機體產生炎癥反應[14]。炎性小體是由受體蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和胱天蛋白酶前體(pro-caspase-1)組成的蛋白酶復合物[15-16],其可通過活化Caspase-1,將IL-1β前體、IL-18前體裂解為成熟的IL-1β和IL-18,進而引起一系列炎癥反應[17],分泌到細胞外的IL-1β可以促進IL-6、TNF-α的促炎作用,而IL-18可以誘導T細胞產生IFN-γ[18],還可以促進其他細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-8等的生成,誘發炎癥產生。炎性小體受體蛋白又包括NOD樣受體蛋白 (NOD-like receptors, NLR) 和AIM2樣受體蛋白 (AIM2-like receptor, ALR),其中NLRP3是NOD樣受體蛋白中研究最多的蛋白,因此對輻射后脾臟組織中炎癥因子及炎性小體水平進行研究有著重要意義。本研究通過ELISA實驗對輻射后脾臟組織中炎癥因子及炎性小體水平進行研究,發現DMF可減輕輻射后脾臟組織炎癥因子及炎性小體水平。進而我們利用Western blot實驗及組織免疫熒光染色對組織中NLRP3、AIM2表達進行研究,結果發現DMF可以減輕輻照所致的炎性小體表達上調。為進一步驗證猜測,我們使用了NLRP3、AIM2激動劑對輻照后脾臟細胞凋亡進行研究,結果顯示NLRP3激動劑、AIM2激動劑能拮抗DMF對脾臟細胞的輻射防護作用。因此,我們認為DMF的輻射防護作用與拮抗NLRP3/AIM2炎性小體密切相關。

綜上所述,DMF可對8 Gy全身輻照小鼠具有防護作用,可提高小鼠生存率,并減輕脾臟輻射損傷。此外,DMF還可抑制炎癥因子及炎性小體的產生,其防護機制與拮抗NLRP3/AIM2炎癥小體密切相關?？傊?我們的研究發現DMF對輻射損傷具有保護作用,提示其具有作為輻射防護劑候選藥物的潛在價值,但其輻射防護作用的精細分子機制尚待進一步研究。