基于網絡藥理學和分子對接方法探討健脾利濕養肝方治療慢加急性肝衰竭的作用機制

黃 琦,李 靜,馬文峰,韓志毅,孫嘉玲,張 衛,孫新鋒,陳劍平,周小舟,

[1. 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院,廣東 廣州 510006;2. 深圳市中醫院國家臨床肝病(中醫)重點?？?廣東 深圳 518033;3. 澳門科技大學中醫藥學院,澳門 999078;4. 深圳市中醫院中藥制劑研究重點實驗室,廣東 深圳 518033]

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是繼發于慢性肝病的一個危急重癥綜合征候群,臨床癥狀復雜多變,并且尚無特效的治療方法。在慢性肝病中的發病率常大于10%,且死亡率可達50%以上[1]。西醫對ACLF的治療主要是處理誘發事件、減少炎癥反應及防止器官衰竭等對癥支持治療。中醫沒有ACLF病名,根據其復雜多樣的癥狀,可將其納入“急黃”、“瘟黃”、“鼓脹”、“血證”、“肝厥”等重癥范疇?，F代中醫總結本病辨證定位多以肝、脾為主,辨證定性則多以濕熱、氣虛為主,病理變化過程多呈現為“濕熱-熱毒-瘀虛”[2]。病久傳脾,而熱邪亦可傷陰血,且“見肝之病,知肝傳脾”,故中醫治療以調和氣血為大法,氣血運行暢達,則病情向好。

前期本課題通過對全國不同區域18家單位962例ACLF及慢性肝衰竭進行多中心大樣本臨床觀察發現：臨床聯合中藥復方治療可有效降低血清內毒素水平、減少并發癥并降低病死率[3]。在此基礎上,篩選出有效中藥方劑健脾利濕養肝方(后簡稱養肝方),其由黃芪、綿茵陳、山藥、山茱萸、草果、田基黃、焦山楂、砂仁、香附組成,具有健脾益氣、清利濕熱的功效[4]。

近年來中醫在理論、臨床、中藥三方面的分子生物研究已經起步,網絡藥理學和分子對接技術可以從中醫理論上拓展生物信息學的空間,在中藥臨床療效基礎上說明分子機制,并深化對中藥的基因研究[5]。本研究基于網絡藥理學和分子對接方法,構建養肝方治療ACLF的中藥-成分-靶點-疾病網絡關系,并對其潛在靶點和分子機制進行了系統地研究。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學方法

1.1.1養肝方活性成分和靶點搜集 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,https：//tcmsp-e.com/)、BATMAN-TCM生物信息學分析平臺(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)及SwissTargetPrediction(http：//swisstargetprediction.ch/)數據庫查找獲得養肝方中黃芪、綿茵陳、山藥、山茱萸、草果、田基黃、焦山楂、砂仁、香附的所有有效成分及作用靶點,選取人源靶點,合并刪除重復靶點。

1.1.2ACLF疾病靶點搜集 使用Acute-on-chronic liver failure及Acute on chronic liver failure作為關鍵詞,搜索DrugBank(https：//www.drugbank.ca/),人類疾病相關的基因與突變位點信息的數據庫(Disgenet,http：//www.disgenet.org/home/),基因數據庫(GeneCards,https：//www.genecards.org/),治療靶標數據庫(TTD,http：//db.idrblab.net/ttd),人類孟德爾遺傳病數據庫(OMIM,https：//www.omim.org/),獲得ACLF疾病相關靶點,合并所有靶點并去除重復靶點。

1.1.3養肝方與ACLF相關靶點交集的構建 養肝方的作用靶點與ACLF疾病靶點使用韋恩圖取交集,獲得養肝方治療ACLF作用靶點。

1.1.4構建PPI蛋白互作網絡關系圖及篩選關鍵作用靶點 將養肝方治療ACLF作用靶點上傳到STRING數據庫 (http：//string-db.org)獲取 PPI信息。置信度得分為 0.7。以 TSV格式導出后由Cytoscape可視化,構建中藥-靶點-疾病的網絡關系圖。使用Cytoscape中Network analyzer和CytoNCA計算網絡拓撲參數及閾值,包括度中心性(degree)、緊密中心性(closeness centrality)、介數中心性(betweenness centrality)。

1.1.5養肝方治療ACLF作用靶點的富集分析 使用注釋及可視化整合分析工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)進行養肝方治療ACLF作用靶點的富集分析,包括基因本體(Gene Ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。依托R語言繪制出GO功能和KEGG通路富集氣泡圖、柱狀圖。

1.1.6關鍵作用靶點和主要活性成分的分子對接 關鍵作用靶點蛋白的3D蛋白結構從蛋白質數據庫PDB(http：//www.rcsb.org/)中獲得。對養肝方有效成分進行兩兩交集求重復性進行排序篩選,后以生物利用度OB值≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選條件,分選出養肝方中的主要活性成分,并通過Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載其3D結構圖。使用AutoDock對蛋白質受體文件和配體文件進行處理,后再進行主要活性成分與關鍵作用靶點的分子對接。使用PyMOL軟件將主要活性成分與關鍵作用靶蛋白之間的相互作用可視化,并顯示為 2D圖。

1.2 體內實驗驗證

1.2.1實驗材料與試劑 雄性C57BL/6J小鼠,6-8周齡,購于廣東省醫學實驗動物中心,適應性喂養1周。養肝方(黃芪20 g、綿茵陳30 g、山藥15 g、山茱萸10 g、草果10 g、田基黃20 g、焦山楂15 g、砂仁5 g、香附10 g)中藥材購自深圳市中醫院。SRC(GB111035)、EGFR(GB111504)購買于Servicebio生物技術公司,VEGFA(bs-1313R)、HRAS(bs-1071R)購買于Bioss公司,STAT3(ab68153)購買于Abcam公司。LPS(L4391)、D-galactosamine(G1639)購買于Sigma公司。本實驗經中科產業控股(深圳)有限公司動物福利倫理委員會批準,批準號：20220059。

1.2.2動物模型構建及給藥 建立肝纖維化小鼠模型,將小鼠隨機分為對照組、模型組和養肝方組,每組4只。第1～8周,對照組腹腔注射生理鹽水,每周2次;模型組及養肝方組腹腔注射四氯化碳溶液(0.2 mL),每周2次。第9～12周,對照組每周3次腹腔注射生理鹽水,模型組每周3次腹腔注射四氯化碳,每天灌胃生理鹽水0.6 mL;養肝方組每周3次腹腔注射四氯化碳,每天灌胃養肝方水煎劑0.6 mL。在上述模型構建成功后,小鼠腹腔注射LPS(10 μg·kg-1)和D-Gal(500 mg·kg-1)的PBS溶液(200 mL),24 h后通過腹腔注射麻醉劑(如三溴乙醇類)對小鼠進行深度麻醉,麻醉穩定后對收集小鼠的肝臟進行檢測。

1.2.3HE染色 取出肝臟,多聚甲醛固定組織48 h時,梯度乙醇及二甲苯脫水透明后石蠟包埋。切片后用蘇木精-伊紅進行染色及封片。

1.2.4免疫組化測定組織內蛋白的表達 將石蠟包埋組織切片后依次放入二甲苯及梯度乙醇脫蠟,后放入檸檬酸鈉抗原修復液沸水煮20 min以組織修復,將抗原修復后切片置于內源性過氧化物酶阻斷劑H2O2并滴加一抗過夜孵育。次日充分洗滌后,切片滴加辣根酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物反應及適量DAB顯色劑,5～20 min終止顯色并封片。

2 結果

2.1 養肝方治療ACLF作用靶點的獲得通過TCMSP數據庫平臺及BATMAN-TCM數據庫,查找得到養肝方的所有化學成分。其中養肝方有536個化學成分,821個基因靶點。利用疾病數據庫,得到1 580個ACLF靶點。通過Venn圖取交集,共得到244個交集靶點,即養肝方治療ACLF作用靶點,見Fig 1。

Fig 1 Venn diagram of drug-disease target intersection

2.2 養肝方治療ACLF靶點蛋白的PPI網絡圖及核心靶點蛋白的篩選養肝方治療ACLF靶點蛋白的PPI網絡圖見Fig 2,共237個點,2 294條邊。選取PPI網絡圖中,度中心性、緊密中心性及介數中心性均較大的7個蛋白為核心蛋白即AKT1、SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、MAPK3、HRAS。養肝方與ACLF交集基因中核心靶點基因的拓撲學參數見Fig 3。

Fig 2 PPI Network diagram of potential target

Fig 3 Core gene screening

2.3 養肝方治療ACLF作用靶點的GO分析結果GO分析包括細胞組分、分子功能及生物過程的分析,見Fig 4。養肝方治療ACLF的生物過程主要包括T細胞共刺激、信號轉導、DNA模板正轉錄調控、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的正調控、平滑肌細胞增殖的正調節等。細胞組分主要涉及轉錄因子復合物、突觸后特化、突觸后密度、質膜、磷脂酰肌醇3-激酶復合物。分子功能主要集中在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、轉錄因子結合、支架蛋白結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄、蛋白酪氨酸激酶活性等。

Fig 4 Visual analysis diagram of biological process, cell composition, molecular function

2.4 養肝方治療ACLF作用靶點的KEGG分析養肝方治療ACLF作用靶點的KEGG分析結果見Fig 5。富集顯著性較高的通路主要包括：癌癥中PD-1和PD-L1檢查點信號抑制通路、JAK-STAT信號通路、趨化因子信號通路、C型凝集素受體信號通路等。表明養肝方主要通過以上通路來治療ACLF。

Fig 5 Visual analysis diagram of KEGG

2.5 養肝方主要活性成分篩選對養肝方536個有效成分的重復性進行排序篩選,再以OB≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選條件過濾,見Tab 1。其中槲皮素重復性為6,且OB=46.43%,DL=0.28,即選擇槲皮素作為后續分子對接的靶點蛋白。

Tab 1 The main active ingredients of JPLSYGF

2.6 槲皮素與核心靶點蛋白分子對接將槲皮素與7個核心靶點蛋白AKT1、SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、MAPK3、HRAS進行分子對接,結合能數據依次為-5.9、-8.2、-7.2、-8.2、-8.6、-6.8、-8.8 kJ·mol-1。一般認為,結合能-5.0 kJ·mol-1,表明這種成分與核心靶點蛋白結合性較好,結合能<-7.0 kJ·mol-1,表明此種物質與核心靶點蛋白有很強結合活性。除槲皮素與AKT1、MAPK3的結合能為-5.9、-6.8 kJ·mol-1之外,其余的結合能均<-7.0 kJ·mol-1,說明槲皮素與核心靶點蛋白結合良好。槲皮素與和核心靶點蛋白分子對接示意圖見Fig 6。

Fig 6 Molecular docking diagram

2.7 動物實驗驗證隨后我們研究了養肝方是否通過以上核心靶點對ACLF發揮治療作用。收集小鼠血清進行生化指標檢驗。Fig 7A、B可見與正常組比較,模型組與養肝方組小鼠血清ALT和AST均升高;且與模型組比較,養肝方組ALT及AST均降低,這說明養肝方對ACLF的肝損傷有保護作用,具有一定的生物安全性。Fig 7C HE染色結果可見,正常組小鼠肝細胞形態正常且連接緊密,結構完整,無炎癥細胞細潤;模型組小鼠的肝細胞腫脹,肝小葉結構紊亂,炎癥及Kupffer細胞浸潤(黑色箭頭處);養肝方組肝損傷細胞減少,細胞形態較為完整,結構基本正常,炎癥浸潤程度也明顯降低(黑色箭頭處)。隨后我們對分子對接的結合能均<-7.0 kJ·mol-1的靶點SRC、VEGFA、STAT3、EGFR、HRAS進行免疫組化實驗,Fig 7D可見與模型組相比,養肝方均可下調HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA蛋白的表達。

Fig 7 In vivo test

3 討論

ACLF是一種具有挑戰性的疾病,其特征在于不同的臨床癥狀、疾病進展快和高短期死亡率。ACLF通常由細菌感染(35%)、消化道出血(22%)和酒精(19%)引發,病理生理學特征為全身性炎癥反應并伴有矛盾的免疫缺陷[6]。這種疾病具有明確的發病機制和流行病學負擔,因此臨床上需要開發特定和有效的療法來治療這種疾病。本研究在前期臨床研究中篩選出有效中藥方劑養肝方,利用網絡藥理學策略,系統地研究養肝方治療ACLF作用的潛在作用靶點和分子機制,并進行動物體內實驗驗證。

GO富集分析顯示,生物過程主要包括T細胞共刺激、信號轉導、RNA聚合酶II對轉錄的正調控等。細胞組分主要涉及轉錄因子復合物、突觸后特化、突觸后密度等。分子功能主要集中在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、轉錄因子結合、支架蛋白結合等。ACLF患者常表現出免疫功能障礙,T淋巴細胞功能障礙是ACLF免疫抑制的重要機制[7]。研究發現,ACLF中的T淋巴細胞功能障礙多表現為T淋巴細胞的凋亡增加、增殖能力減弱及反應性降低[8]。KEGG分析顯示,富集顯著性較高的通路主要包括癌癥中PD-1和PD-L1檢查點信號抑制通路、JAK-STAT信號通路、趨化因子信號通路、C型凝集素受體信號通路等。PD-1主要在活化的CD8+T淋巴細胞中表達,其配體是PD-L1/PD-L2,PD-L1/PD-L2共刺激信號通路在T淋巴細胞活化、增殖及分泌細胞因子中起重要的負調節作用[9]。Li等[10]發現SOCS3主要通過JAK/STAT3信號通路執行其信號轉導中的負調節作用,且其表達水平在HBV-ACLF患者的肝臟組織和PBMC中均顯著升高,并與肝損傷程度呈正相關?？偨Y以上研究提示,PD-1/PD-L1信號通路、JAK/STAT信號通路可能在ACLF的發生和發展中起著重要作用。

本研究選取養肝方治療ACLF的7個核心靶點蛋白中結合能前5的HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA蛋白進行了實驗驗證。HRAS參與RAS/MAPK途徑,負責控制基因轉錄活動和細胞循環周期,與細胞增殖有關[11]。HRAS蛋白處于持續激活狀態時可導致細胞增殖失控[12]?？梢娔Ｐ徒MHRAS高度活躍,同時養肝方可以下調HRAS表達并可維持正常細胞周期。RAS/MAPK途徑也是EGFR下游通路之一,EGFR的過表達或發生突變時,也會導致細胞異常增殖[13]。本實驗中模型組可見EGFR高度表達,相反養肝方逆轉了這一趨勢。SRC作為一種人類普遍表達的蛋白酪氨酸激酶,其異常激活可促進內皮-間充質等過程,將正常細胞轉為癌細胞[14]。Du等[15]通過抑制SRC的激活,可阻止肝星狀細胞的增殖和遷移,以延緩肝纖維化進程。同樣的,養肝方可以抑制SRC的激活,這說明養肝方也可延緩慢性肝病肝臟的纖維化進程。Sole等[16]通過對比研究55名肝硬化患者發現ACLF患者血漿細胞因子中的VEGFA與ACLF關系最顯著。肝組織炎癥及損傷后模型組VEGFA分泌增加,血管通透性增加,炎癥細胞及細胞因子浸潤增加,放大了炎癥信號,導致血管滲透、水腫及炎癥[17]。養肝方可降低體內炎癥反應,下調VEGFA表達。促進肝細胞再生是ACLF的重要方面,而STAT3與肝臟促再生途徑有關。Xiang等[18]研究發現,IL-6/STAT3通路的破壞會過度激活IFN-γ/STAT1通路導致肝再生能力減弱,STAT3途徑的下調有利于ACLF的恢復。這與HE的實驗結果一致,同樣在本研究中ACLF小鼠表現出顯著激活的STAT3信號傳導,養肝方下調了STAT3的表達。

綜上所述,養肝方具有健脾益氣、清利濕熱的功效,其可以作用HRAS、EGFR、STAT3、SRC、VEGFA等核心靶點,通過控制細胞增殖、維持細胞周期、抑制內皮-間充質及炎癥反應,以達到治療ACLF的作用。