基于網絡藥理學方法與分子對接技術探究左西孟旦治療低氧肺動脈高壓的作用機制

張曉丹,謝玉良,高夢丹,袁奧雪,李涵飛,祝田田

(1. 新鄉醫學院藥學院,2. 河南省心血管重構與藥物干預國際聯合實驗室,3. 新鄉市心血管重構干預與分子靶向治療藥物研發重點實驗室,河南 新鄉 453003)

低氧肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是高原地區普遍的心血管疾病,主要指長期低氧條件下,肺動脈壓異常持續性升高,心肺功能代償性增加,肺動脈發生異常重塑的進行性疾病[1]。高海拔地區居民因長期暴露于低氧環境,右心室壓力負荷增大,常發生右心衰竭和過早死亡[2]。此類疾病目前仍不可完全治愈,且預后較差,HPH的早期診療對控制疾病發展進程至關重要。目前HPH的治療方法有氧療法和藥物療法等。傳統治療藥物包括前列腺素受體激動劑、磷酸二酯酶5抑制劑、內皮素受體拮抗劑等,雖有一定療效但普遍作用不佳[3]。因此,尋找更好的治療藥物對控制HPH患者的病程發展及提升生活質量意義重大。

左西孟旦(levosimendan,LEVO)于2000年在歐洲上市應用,是一類新型鈣增敏作用的正性肌力藥,在心血管類疾病的治療中具有多效性。其作用主要包括選擇性收縮期鈣增敏的正性肌力作用、開放三磷酸腺苷依賴性鉀通道的舒血管作用,以及抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡作用等[4]。因其獨特的作用機制,近年來,LEVO臨床應用廣泛,包括晚期心力衰竭、心源性休克、心臟手術、肺動脈高壓等[5],但說明書中主要適應癥為心力衰竭,其他超說明書用法仍需各種研究驗證。本研究旨在通過動物實驗、網絡藥理學方法與分子對接技術,探討LEVO對HPH的治療作用及潛在機制,為進一步開拓LEVO的應用范圍及尋找HPH的更佳治療方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物實驗探究LEVO對HPH的治療作用

1.1.1HPH模型的構建 清潔級SD大鼠,♂,體質量180～220 g,購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司[生產許可證號：SCXK(豫)2020-0005]。實驗動物在相對濕度45%～65%、溫度(23±1)℃、通風良好和氧氣充足的條件下飼養。24只SD大鼠隨機分為常氧組(control)、常氧+LEVO組(LEVO)、低氧組(hypoxia)、低氧+LEVO組(hypoxia+LEVO)。常氧的兩組大鼠正常飼養,低氧的兩組大鼠于同室的常壓低氧培養倉內飼養,連續飼養4周。期間給予LEVO的兩組大鼠按照24 μg·kg-1的劑量每周腹腔注射1次(LEVO購自山東齊魯制藥有限公司),另外兩組大鼠同時注射等量生理鹽水。實驗期間每天觀察大鼠狀態,定時更換飼料、墊料、飲用水等。

1.1.2檢測大鼠右心指標 造模結束后,稱量并記錄所有大鼠體質量。使用右心導管法測定大鼠的右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP),判斷造模是否成功。之后處死大鼠,分離左右心室及室間隔,并稱重,測量脛骨長度,計算右心肥厚指數并做統計圖。

1.1.3肺組織切片及形態學染色分析 采集所有大鼠肺組織進行石蠟包埋與切片。進行HE、Masson和VG染色,使用光學顯微鏡觀察大鼠肺組織病理學變化。拍照保存后進行數據分析,并繪制統計圖。

1.2 LEVO治療HPH的網絡藥理學分析

1.2.1建立LEVO藥物靶點庫 LEVO作為一種新興的化學藥物,在許多常用的數據庫中并未收錄或預測靶標較少。使用檢索詞“levosimendan”在Swiss Target Prediction、DrugBank Online、BatMan、Targetnet、SEA、PharmMapper數據庫中檢索(Tab 1)。部分檢索結果需要使用UniProt數據庫匹配基因名稱,將所得結果合并,刪除重復項后得到藥物靶點庫。

Tab 1 Network pharmacology involved database information

1.2.2建立HPH疾病靶點庫 HPH是第三類肺動脈高壓,在GeneCards、OMIM數據庫中檢索“hypoxic pulmonary hypertension”,對檢索結果進行相應篩選,整合后刪除重復項即得。

1.2.3確定共同靶點并構建“藥物-靶點-疾病”關系網絡 分別導入藥物與疾病對應靶點,使用Venny2.1.0在線工具對二者進行取交,得到共同靶點,并保存供后續篩選使用。將藥物、疾病和交集靶點制成腳本后導入Cytoscape3.9.0軟件,合理調整位置后,制成“藥物-靶點-疾病”關系網絡圖。

1.2.4構建蛋白互作(PPI)網絡并篩選核心靶點 將上述得到的共同靶點導入STRING數據庫,對參數進行設置：限制物種為“homo sapiens”,要求最低相互作用分數為“high confidence >0.9”,將不互動的單一靶點隱藏,其他默認設置,即得到構建好的PPI網絡圖。導出圖片,將生成的TSV文件轉移至Cytoscape3.9.0軟件中進行可視化處理,并利用Degree值進行篩選分析,得到核心靶點。

1.2.5進行GO生物學功能和KEGG通路富集分析 將經PPI篩選后的靶點導入DAVID數據庫進行GO生物學功能和KEGG通路富集分析,限制物種同上。數據處理標準為P<0.01,按照Count值進行降序排列,用微生信網站進行可視化,獲得LEVO治療HPH的生物過程、細胞組成、分子功能及相關信號通路關系圖。

1.2.6對核心靶點進行分子對接 選取Degree值前5的蛋白與LEVO進行分子對接。首先獲取LEVO小分子文件：在PubChem數據庫中查找“levosimendan”,下載其3D結構文件,并通過Open Bable 2.4.1將文件轉化為mol2格式。其次獲取蛋白結構文件：在Uniprot數據庫分別篩選Degree值前5的蛋白,選擇分辨率高、結構完整的蛋白結構,并進入PDB數據庫下載對應的pdb文件。然后對小分子和蛋白進行預處理：使用PYMOL軟件去除受體蛋白的水分子和配體等,之后將小分子文件和受體蛋白文件分別置于AutoDockTools1.5.7中加氫并平衡電荷。最后在AutoDockTools1.5.7中分別進行LEVO與5個受體蛋白的分子對接,記錄各自結合能,并將對接結果轉入PYMOL進行可視化處理。

2 結果

2.1 LEVO對HPH的治療作用

2.1.1LEVO對右心收縮壓及右心重構指數的影響 Fig 1結果顯示,造模結束后,低氧組大鼠相較于常氧組體質量明顯下降,RVSP、右心室與左心室加室間隔重量比值(weight ratio of right ventricle to left ventricle plus ventricular septum,RV/LV+S)及右心室重量與脛骨長度的比值(ratio of right ventricular weight to tibial length,RV/TL)明顯升高(P<0.01),說明持續低氧使大鼠的心肺功能異常改變,出現了肺血管重構和右心肥厚。給予LEVO后,與低氧組相比,低氧+LEVO組大鼠體質量增加(P<0.05),RVSP、RV/(LV+S)和RV/TL明顯降低(P<0.01),而與常氧組相比,各項指標差異均無顯著性(P>0.05)。以上結果表明,LEVO能明顯改善HPH大鼠的肺血管重構,使肺動脈壓趨于正常。

Fig 1 Results of body weight (A), RVSP (B), RV/(LV+S) (C) and RV/TL (D) in n=6)

2.1.2LEVO對肺組織的影響 肺部組織的異常病理學改變可通過染色的方法從顯微鏡下觀察得到。HE染色結果發現(Fig 2A,2B),對比常氧組,低氧組大鼠的肺血管壁出現明顯增厚,管腔內空隙明顯減少,肺動脈壁厚度與血管外徑的比值明顯增加(P<0.01)。LEVO治療后,對比低氧組,低氧+LEVO組的肺血管壁肥厚情況受到抑制,肺動脈壁厚度與血管外徑的比值明顯減小(P<0.01),可見病理損傷相對改善。

Masson和VG染色結果均表明(Fig 2C-F),低氧組大鼠肺組織內膠原纖維沉積明顯,肺部纖維化嚴重,與常氧組相比肺纖維化相對面積明顯增大(P<0.01)。給予LEVO后,低氧+LEVO組的肺纖維化相對面積比低氧組明顯減小(P<0.01),肺部纖維化程度受到有效抑制。綜合上述染色結果可知,LEVO可以在不影響常氧組大鼠正常肺組織形態的情況下,明顯改善HPH大鼠的肺血管重構,使其異常病理改變程度減輕并趨于正常。

Fig 2 Rat lung tissue determined by HE, Masson and VG n=6)

2.2 網絡藥理學和分子對接結果分析

2.2.1LEVO靶點預測 通過檢索多個數據庫：Swiss Target Prediction、DrugBank Online、BatMan、Targetnet、SEA、PharmMapper,分別得到LEVO對應靶點基因6、4、29、80、5、272個,去重后整合,最終得到357個藥物靶點。

2.2.2HPH靶點預測 在GeneCards、OMIM數據庫中分別檢索到HPH對應靶點3 730、256個,對其進行簡單篩選,保留相關性評分≥2的靶點,整合去重后最終獲得2 451個疾病靶點。

2.2.3LEVO與HPH交集靶點網絡 將357個藥物靶點與2 451個疾病靶點導入Venny2.1.0中,對二者進行互相映射,得到交集靶點174個,整理并保存(Fig 3)。將LEVO、HPH以及174個共同靶點整理成腳本文件,并導入Cytoscape3.9.0軟件中進行可視化操作,繪制“LEVO-交集靶點-HPH”網絡圖(Fig 4)。

Fig 3 Venn diagram of intersection of LEVOtargets and HPH targets

Fig 4 Network diagram of “LEVO-intersection target-HPH”

2.2.4PPI網絡與關鍵靶點 在STRING數據庫中輸入上述174個交集靶點,物種設置為“homo sapiens”,最低置信度要求為0.9,并隱藏無聯系的單一靶點,得到PPI網絡圖(Fig 5)。把PPI網絡對應的TSV文件導入Cytoscape3.9.0進行可視化,得到139個點和525條邊。選擇“Analyze Network”對其進行分析,得到每個節點對應的Degree值。根據Degree值將139個關鍵靶點進行降序排列,按照大小調整位置,繪制成關鍵靶點圖(Fig 6),并把排名前5的靶點(SRC、HSP90AA1、MAPK1、PIK3R1、AKT1)作為LEVO治療HPH的核心靶點。

Fig 5 PPI network map of LEVO action on HPH

Fig 6 Key targets for LEVO treatment of HPH

2.2.5GO生物學功能富集分析 為進一步探索LEVO治療HPH的潛在作用機制,將上述篩選后的139個關鍵靶點導入DAVID數據庫進行GO生物學功能富集分析。共得到GO富集結果381條,分別為生物過程(biological process,BP)267條、細胞組成(cellular component,CC)40條及分子功能(molecular function,MF)74條,并對各項中排名前10的數據進行可視化(Fig 7)。其中BP主要涉及信號轉導、蛋白質磷酸化、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調控、細胞凋亡過程的負調控等。

Fig 7 GO biological function enrichment analysis

2.2.6KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析同樣在DAVID數據庫中進行,共得到136條富集通路,將Count值≥19的前23條通路在微生信平臺上進行可視化(Fig 8)。其中主要包括癌癥通路、前列腺癌、FoxO信號通路、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、脂質和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路等。

Fig 8 Top 23 for KEGG pathway enrichment analysis

2.2.7分子對接 將LEVO與上述Degree值排名前5的核心靶點進行分子對接,從而預測其結合模式與結合性能。核心靶點的蛋白結構從PDB數據庫中獲取,分別為：SRC(PDB：2SRC)、HSP90AA1(PDB：5XRD)、MAPK1(PDB：8AOJ)、PIK3R1(PDB：7CIO)、AKT1(PDB：1UNQ)。由LEVO與受體蛋白的對接結合能(Tab 2)可知,數值均小于-5 kcal·mol-1,表明5個核心靶點與LEVO均有較好的結合性,其中結合能最低的是Degree值最高的核心靶點SRC。分子對接可視化結果(Fig 9)表明,小分子LEVO能夠通過氫鍵與受體蛋白SRC的氨基酸殘基LEU-89、TYR-90、LYS-249、PRO-250、THR-252和TYR-326結合,從而形成穩定構象。

Fig 9 Plot of molecular docking pattern of LEVO to core target site

Tab 2 Binding energy of levosimendan to core targets

3 討論

本研究構建HPH大鼠模型,通過檢測各項特征性指標及HE、Masson、VG染色,探究了LEVO對HPH的治療作用。實驗結果表明,LEVO能夠明顯增加HPH大鼠的體質量,明顯降低其RVSP、RV/(LV+S)和RV/TL,同時能使HPH大鼠肺部的異常病理改變恢復至相對正常。因此,動物實驗結果很好地證明了LEVO對HPH具有治療作用。

HPH病因復雜,有著較高的發病率和死亡率,有研究發現無論是高海拔地區還是平原區域,HPH的患病率呈現逐年上升趨勢,且平原地區患者的心肺功能較高原地區患者更差[6]。當前對于HPH的具體發病機制仍未完全闡明。LEVO在上市以來的20多年間,除了主要治療心力衰竭以外,也被嘗試性用于許多其他臨床疾病,包括肺動脈高壓。有非臨床研究表明,LEVO可減輕豬的缺氧性肺血管收縮,并改善持續缺氧導致的心臟抑制[7]。此外,有臨床研究選取了126例肺動脈高壓老年患者進行試驗,結果對比常規氧療組發現,加用LEVO治療的試驗組改善患者臨床癥狀的效果更好,且能明顯提高患者的生活質量[8]。目前LEVO與HPH的研究相對較少,且多聚焦于合并用藥時的療效探究。雖然有研究認為LEVO改善肺血管重構的作用可能與細胞超極化介導的抗炎與抗增殖作用有關[9],但是其具體機制還需通過實驗進行深入探究。

網絡藥理學的結果表明,經PPI分析后,LEVO作用于HPH的關鍵靶點有139個,包括SRC、HSP90AA1、MAPK1、PIK3R1、AKT1、HRAS、MAPK14、LCK、EGFR、ESR1等。GO富集分析發現,信號轉導、蛋白質磷酸化和細胞凋亡過程在其中發揮著重要作用,KEGG分析主要富集在癌癥通路、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路等。有研究發現,LEVO可抑制抑癌蛋白PTEN的活性,負反饋激活PI3K/AKT信號通路,發揮抗細胞凋亡的作用[10-12]。此外,Ras與MAPK信號通路之間的串話可能參與肺血管重構,從而影響HPH的發生發展[13]。

將分析后Degree值排名前5的關鍵靶點作為LEVO治療HPH的核心靶點,并分別與LEVO進行分子對接。結果顯示均具有良好的結合性能,表明這些受體蛋白可能是LEVO對HPH發揮治療作用的潛在位點,其中SRC的結合效果尤為顯著。有研究發現,抑制蛋白酪氨酸激酶SRC磷酸化可抑制缺氧誘導因子1α的表達,進而抑制肺動脈高壓中肺動脈平滑肌細胞的遷移與增殖,且該研究認為靶向SRC激活的抑制劑可能使肺動脈高壓發生逆轉[14]。此外,SRC家族酪氨酸激酶被認為可能參與肺動脈平滑肌細胞鉀離子通道的調控[15],且SRC抑制劑可抑制LEVO誘導的AKT磷酸化[16]。但是SRC如何在LEVO治療HPH的過程中發揮作用,仍需進一步探索。

綜上,本研究將動物實驗、網絡藥理學方法及分子對接技術相結合,驗證了LEVO對HPH大鼠確有治療作用,能夠減輕HPH的肺血管重構,并且發現LEVO可通過結合多靶點和調控多通路發揮此作用,但其中具體作用機制還需進一步探究,這也為我們后續的實驗提供了研究方向。