基于YWHAZ/p38MAPK/CASP3信號通路探討軟脈煎治療動脈粥樣硬化的機制

趙 雪,顧 耘,張 璐,杜文婷

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海 200032)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)被認為是一種進行性血管慢性炎癥性疾病,也是世界上心血管疾病致死的主要原因之一[1]。前瞻性研究表明低密度脂蛋白與缺血性心臟病死亡率之間存在著強烈的正相關關系,國際公認的針對性治療藥物——他汀類已經被廣泛應用于臨床[2]。但是AS是一個復雜的生理、病理過程,單一作用靶點并不能完全滿足臨床預防和治療的需要,目前中醫藥多靶點干預在AS治療方面展現出優勢。

中藥復方軟脈煎(RMJ)是上海名中醫顧耘教授的經驗方,由熟地黃、黃芪、陳皮、肉蓯蓉、荷葉、絞股藍6味中藥組成,方中熟地黃、黃芪補益精氣,陳皮理氣健脾、燥濕化痰,荷葉升陽利濕、散瘀止血,絞股藍健脾益氣、清熱解毒,肉蓯蓉補腎陽、益精血。前期課題組已證實RMJ可以保護血管內皮、抑制血管平滑肌生長、調節血脂、減小頸動脈斑塊面積及改善臨床癥狀[3]。通過網絡藥理學,我們可以從大數據中識別藥物與疾病的靶點,進一步探究其作用機制和相關通路[4]。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1RMJ藥物活性成分及靶點收集 采用中醫藥整合藥理學網絡計算研究平臺TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology),搜索RMJ中熟地黃、黃芪、陳皮、肉蓯蓉、荷葉、絞股藍6味中藥的活性成分及其對應的靶點,隨后根據藥動學性質參數(ADME)進行篩選,設置生物利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18。

1.1.2“藥物-活性成分-靶點”網絡構建 采用Uniport(https：//www.uniprot.org/)數據庫對藥物靶點名稱進行標準化處理,利用軟件Cytoscape3.8.2繪制“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。

1.1.3疾病靶點收集 以“Atherosclerosis”為關鍵詞在DrugBank(https：//go.drugbank.com/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM (online mendelian inheritance in man)網站進行檢索,獲得AS的相關靶點。

1.1.4PPI網絡構建 借助Cytoscape3.8.2軟件中的插件Bisogenet將藥物活性成分靶點和AS疾病靶點導入并“merge”兩個網絡獲得交集網絡,對交集網絡進行拓撲分析(連接度、緊密度等),獲得核心靶點相互作用網絡。

1.1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將RMJ治療AS的潛在靶點導入David(https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫進行GO及KEGG富集分析。

1.2 分子對接采用Seesar軟件將排名關鍵成分分別與核心靶點進行分子對接,計算其結合能力,根據親和度排序,篩選出親和度值小于1 000 000 nm的成分。使用基于結構的建模支持服務器(https：//proteins.plus/)展示對接結果的3D、2D結構。

1.3 實驗驗證

1.3.1實驗材料 ①動物：SPF級ApoE-/-C57BL/6J小鼠30只,C57BL/6J小鼠10只,8周齡,雄性,體質量(20±2)g,購置于北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號20210006。動物飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心,溫度(24±2) ℃,濕度65%～75%,設置12 h光暗循環,自由飲水。C57BL/6J小鼠普飼,ApoE-/-C57BL/6J小鼠高脂飼養,高脂飼料由78.85%基礎飼料、21%脂肪、0.15%膽固醇組成,購置于上海帆泊生物,合格證號：(2022)05005。動物實驗符合動物福利與倫理相關規范,倫理編號：PZSHUTCM220926004。②藥物：RMJ顆粒劑(包括黃芪15 g、陳皮6 g、肉蓯蓉12 g、熟地15 g、荷葉15 g、絞股藍30 g)購置于上海中醫藥大學附屬龍華醫院,生產批號：21090158,蒸餾水溶解。③試劑：GAPDH抗體(CST,5174),Cleaved caspase3 抗體(CST,9664S),p-p38 MAPK 抗體(CST,4511S) ,YWHAZ 抗體(Santa Cruz,sc-518031) ,預染蛋白Marker(莫納,PE30301),RIPA裂解液(雅酶,PC101),BCA蛋白定量試劑盒(雅酶,ZJ101),TBSTw(碧云天,ST673)。④儀器：全自動生化分析儀(深圳雷杜生命),電泳儀(上海天能科技),蛋白印跡智能成像系統(ThermoFisher Scientific),病理切片機(上海徠卡),光學顯微鏡(日本Olympus),臺式高速冷凍離心機(德國Eppendoref),超純水機(美國艾肯)。

1.3.2實驗方法 ①造模、分組和給藥：小鼠適應性飼養1周,C57BL/6J小鼠(10只)設為對照組予普飼,30只ApoE-/-C57BL/6J小鼠高脂飼養12周建立AS模型,隨機挑選3只取主動脈進行油紅染色鑒定造模結果,將AS模型小鼠隨機分為模型組(9只),RMJ高劑量組(9只),RMJ低劑量組(9只)。將RMJ顆粒劑用蒸餾水配置成混懸液,以70 kg成人等效劑量換算,RMJ高劑量組小鼠每日給藥16.38 g·kg-1,低劑量組每日給藥8.19 g·kg-1模型組和對照組予等劑量蒸餾水灌胃,灌胃時間為12周。②觀察指標：血脂測定：末次給藥后禁食12 h摘眼球取血,室溫靜置2 h,4 ℃、3000 r·min-1離心15 min,取上清,全自動生化儀自動測定各組血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。主動脈病理切片染色：將采血后的小鼠開胸暴露心臟,心臟灌注生理鹽水后采用4%多聚甲醛固定,OCT包埋切片后進行常規HE、Masson和天狼猩紅染色。免疫熒光檢測：主動脈病理切片用3%BSA室溫封閉1 h,1 ∶100稀釋Mac2抗體4 ℃孵育過夜,1 ∶1 000稀釋二抗室溫孵育1 h,1 ∶7 000稀釋DAPI染色15 min,封片,熒光顯微鏡下拍照,ImageJ軟件分析圖像。Western blot檢測主動脈蛋白的表達水平：將主動脈進行研磨、超聲,RIPA裂解液冰上裂解30 min,離心取上清,BCA試劑盒檢測蛋白濃度,各組濃度配制相同。制膠,上樣(10～30 μg)。電泳,轉膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,1 ∶1 000稀釋一抗4 ℃孵育過夜,1 ∶1 000稀釋二抗孵育2 h,1 ∶1配制顯影液顯影,ImageJ軟件分析圖像。

1.3.3實驗結果統計 采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析,計量資料符合正態分布且方差齊,多組比較用One-way ANOVA單因素方差分析,組間兩兩比較采用Turkey檢驗;顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

2.1.1RMJ藥物活性成分及其作用靶點篩選 RMJ通過TCMSP平臺共篩選了72個藥物活性成分,其中熟地黃2個,黃芪20個,陳皮5個,肉蓯蓉6個,荷葉15個,絞股藍24個,將上述藥物活性成分作用靶點去除重復項后共得到199個。

2.1.2AS靶點收集 于DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD數據庫以“Atherosclerosis”為關鍵詞進行檢索,去重后共得到疾病靶點4129個,將RMJ藥物靶點與AS疾病靶點取交集得到168個交集靶點,用Venny2.1制作韋恩圖(Fig 1)。

Fig 1 Drug-disease targets

2.1.3PPI網絡構建 借助Cytoscape3.8.2軟件中的插件Bisogenet將藥物作用靶點和AS疾病靶點導入并“merge”兩個網絡獲得交集網絡,最終得到107個核心靶點的PPI網絡(Fig 2)。其中Degree值> 55的靶點有7個：NPM1、HSPA5、YWHAZ、HSPA8、TP53、MCM2、UBC,定義這7個靶點是治療AS的核心靶點(Tab 1)。

Fig 2 Protein-protein interaction (PPI) network

Tab 1 Key targets

2.1.4GO和KEGG富集分析 將RMJ藥物與AS疾病的交集靶點導入DAVID數據庫進行GO和KEGG富集信號通路分析,生物過程(BP)753個,主要有RNA聚合酶II啟動子轉錄的正規調節、細胞質結合、酶結合等,細胞成分(CC)84個,主要有胞液、細胞核、核膜、細胞質等。以P≤0.05為標準,并以P值升序排列,篩選出 BP、MF、CC前10個采用生信網進行繪圖分析(Fig 3)。KEGG富集分析得到170條信號通路,以P<0.05為篩選條件,篩選出前20條通路(Fig 4),主要包括癌癥的途徑、脂質和AS、血流剪切應力和AS、活性氧(ROS)、炎癥信號通路等。

Fig 3 Gene ontology (GO) analysis

Fig 4 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis

2.2 分子對接結果選擇10個關鍵成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)、7-O-甲基異木糖醇(7-O-methylisomucronulatol)、諾比列汀(nobiletin)、芒柄花素(formononetin0、柚皮素(naringenin)、阿美巴芬(armepavine)、豆甾醇(stigmasterol)、鄰去甲花堿(o-Nornuciferine)與核心靶點NPM1、HSPA5、YWHAZ、HSPA8、TP53、MCM2、UBC進行分子對接。采用Seesar軟件將關鍵成分分別與核心靶點的最佳結合口袋進行分子對接,計算其結合能力,根據親和度排序,篩選出親和度值小于1 000 000 nm的成分如下,docking結果表明槲皮素、山柰酚、諾比列汀、柚皮素、阿美巴芬、豆甾醇、鄰去甲花堿與核心靶點蛋白有很強的結合能力,見Tab 2。Fig 5展示了核心靶點蛋白與關鍵化合物的分子對接3D結構。

Tab 2 Protein-molecule binding affinity

Fig 5 Protein-molecule docking 3D structures

2.3 實驗驗證結果

2.3.1主動脈HE、Masson、天狼猩紅染色 HE染色結果示(Fig 6)：與對照組相比,模型組主動脈相對斑塊面積明顯增大(P<0.01),并且含有更多的泡沫細胞和膽固醇結晶;與模型組相比,RMJ高劑量組和低劑量組主動脈斑塊面積明顯減小(P<0.01),并且泡沫細胞和膽固醇結晶含量減少。Masson、天狼猩紅染色結果示：與對照組相比,模型組膠原相對含量明顯下降(P<0.01);與模型組相比,RMJ高劑量組膠原相對含量明顯增高(P<0.01或P<0.05),RMJ低劑量組膠原相對含量增高不明顯(P>0.05)。病理結果顯示RMJ高劑量組治療效果較最佳,后續將重點比較RMJ高劑量組(RMJ組)與模型組差異。

Fig 6 Aorta HE, Masson, and picrosirius red staining

2.3.2RMJ對AS模型小鼠血脂的影響 與對照組相比,模型組小鼠的TG、TC、LDL-C水平明顯升高(P<0.01或P<0.05),HDL-C水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,RMJ組TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.05),見Fig 7。

Fig 7 TG, TC, LDL-C, HDL-C detection results

2.3.3RMJ對AS小鼠主動脈Mac2、YWHAZ蛋白表達的影響 與對照組相比,模型組Mac2(巨噬細胞標志物)、YWHAZ蛋白相對表達量明顯增高(P<0.01);與模型組相比,RMJ組Mac2、YWHAZ蛋白相對表達量明顯降低(P<0.01或P<0.05),見Fig 8。

Fig 8 Immunofluorescence detection of Mac2 and YWHAZ protein expression

2.3.4RMJ對AS小鼠主動脈p-p38MAPK、c-CASP3蛋白表達的影響 與對照組相比,模型組p38MAPK磷酸化水平和c-CASP3蛋白表達水平明顯升高(P<0.01或P<0.05),與模型組相比,RMJ組p38MAPK磷酸化水平和c-CASP3蛋白表達水平明顯下降(P<0.01或P<0.05)見Fig 9。

Fig 9 Western blot detection of p-p38MAPK and c-CASP3 protein expression

3 討論

通過網絡數據庫篩選和分子對接驗證,我們最終獲得了槲皮素、山柰酚、諾比列汀、柚皮素、阿美巴芬、豆甾醇、鄰去甲花堿7個關鍵活性成分,其中荷葉含有槲皮素、山柰酚、阿美巴芬、鄰去甲花堿,黃芪含有槲皮素、山柰酚,陳皮含有諾比列汀、柚皮素,肉蓯蓉含有槲皮素,絞股藍含有槲皮素,熟地黃含有豆甾醇。槲皮素被證實不僅可以降低血漿和主動脈中總膽固醇、總脂肪酸和TG的含量,還可以有效抑制乳糜連接素15脂氧合酶進而抑制低密度脂蛋白的合成[5- 6];山柰酚被證實可以防止異位脂質積累[7],槲皮素、山柰酚屬于黃酮類化合物,已有研究證實黃酮類化合物具有抗炎特性[8];諾比列汀可以通過增強miR-590對脂蛋白脂酶表達的抑制作用來減輕促炎細胞因子的分泌和脂質積累,進而改善血管內皮功能[9- 10];柚皮素可以減少斑塊巨噬細胞并增加平滑肌細胞[11];阿美巴芬通過抑制T細胞/巨噬細胞的浸潤、降低炎癥細胞因子水平起到抗炎、調節免疫的作用[12];豆甾醇可以通過調節肝X受體基因表達降低血清膽固醇水平[13];鄰去甲花堿可能通過調節膽汁分泌、甘油脂、鞘脂代謝和過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路等來調節脂質代謝[14]。通過篩選的關鍵化合物,我們總結RMJ可以通過調節脂質代謝、改善血管內皮功能、抗炎和調節免疫治療AS。

通過RMJ治療AS的靶點進行GO和KEGG富集信號通路分析,可以獲得RMJ治療AS疾病密切相關的生物過程和信號通路。在GOBP分析中,顯示RMJ可以干預AS細胞增殖、細胞凋亡和細胞因子介導的信號通路。血管平滑肌細胞的增殖和新內膜的形成加重了AS病變的發展[15],另有研究顯示造血干細胞增殖可以加速克隆性造血導致AS疾病加重[16];晚期AS斑塊中血管平滑肌細胞功能受損的原因可能是細胞死亡或衰老[17];在一項用人類內皮細胞模擬屏障功能受損的研究中,發現細胞因子刺激后的內皮屏障功能減弱[18]。另外,KEGG分析顯示：RMJ治療AS與脂質代謝通路、流體剪切應力調節、ROS以及TNF、MAPK、PI3K-Akt 、IL-17信號通路相關。脂質積累是AS的主要病因之一,AS通常與脂質代謝異常和高脂血癥相關[19];已有研究表明,在細胞成熟期間施加流體剪切應力可以有效減少脂質積累[20];由過量ROS引起的氧化應激已經被證實為AS的關鍵發病機制[21],ROS直接增加炎癥和黏附因子的表達、氧化低密度脂蛋白的形成等,它們激活泛素通路,降低內皮一氧化氮合酶活性,抑制腺苷一磷酸(AMP)蛋白激酶和脂聯素的激活,所有這些都會加速AS進展[22];已經有明確的臨床和實驗證據證明AS是一種慢性炎癥性疾病[23],機制研究表明,促AS因子(TNF-α)是程序性細胞清除受損的一種基本驅動因素,由此造成病變血管細胞和凋亡細胞碎片病理積累形成慢性炎癥[24];IL-17對AS具有一個雙向的影響作用,一方面可以誘導炎癥和細胞凋亡,另一方面它又可以通過促進纖維帽形成來穩定斑塊[25];PI3K/Akt通路通過調控巨噬細胞的存活、增殖和遷移影響AS的發展[26];MAPK參與炎癥信號傳導,并響應各種細胞內、外刺激而促進氧化應激[27]。通過GO 和 KEGG 富集信號通路分析我們總結RMJ可以通過抗炎、影響細胞增殖與凋亡、調節脂質代謝、減少氧化應激、改善內皮功能來治療AS。

本次實驗驗證了與AS發生發展關系密切的MAPK信號通路,其中p38MAPK途徑主要作用于炎癥和免疫。前期篩選出的YWHAZ是p38MAPK信號通路的正調節劑,YWHAZ低表達可以通過抑制MAPK信號通路減少血管平滑肌細胞增殖和內膜增生[28],并且YWHAZ涉及多種信號轉導途徑,其中包括表皮生長因子受體(EGFR)信號[29],EGFR缺失可以限制IL-6和TNF-α的產生、脂質攝取進而抑制動脈粥樣硬化進展[30]。CASP3(caspase-3)是細胞中的一種蛋白酶,通常以未激活狀態存在。當CASP3被激活并自我切割時,會產生c-CASP3(cleaved caspase-3)。因此,在細胞凋亡過程中,c-CASP3的表達量通常會增加,因為CASP3的活性增加[31]。炎癥觸發p38MAPK途徑激活和黏附分子表達[32],進而誘發凋亡,c-CASP3表達增高[33]。

我們首次運用網絡藥理學探究補腎類中藥復方RMJ治療AS的作用機制。核心靶點的探究驗證了課題組以往的部分研究成果：RMJ可以抑制對平滑肌有增生作用的IL-6表達進而改善內皮功能[34];在AS晚期通過Bax/Bcl-2異源二聚體與Bax-Bax同源二聚體競爭Bax減少同源二聚體的形成,從而抑制血管平滑肌細胞的凋亡來提高斑塊的穩定性[35];RMJ早期可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,促進自噬防治AS,晚期可以促進PI3K/Akt/mTOR信號通路,抑制過度自噬穩定AS斑塊[36]。本研究通過動物實驗驗證了RMJ可以通過下調關鍵靶點YWHAZ及p-p38MAPK、c-CASP3調控p38MAPK信號通路,減輕AS炎癥反應及炎癥誘發的凋亡。課題組未來將繼續關注并驗證RMJ通過誘導糖酵解和TIGAR影響細胞自噬,影響泛素化和細胞衰老等治療AS的作用機制。