鐵調素水平與骨代謝相關性臨床及實驗研究

王一可 劉功穩 王雄毅 張睿智 劉煒峰 謝伊代·如則 李俊杰 徐又佳,3*

1. 蘇州大學附屬第二醫院骨科,江蘇 蘇州 215000

2. 蘇州市中醫院,江蘇 蘇州 215000

3. 蘇州大學附屬第二醫院骨質疏松癥臨床中心,江蘇 蘇州 215000

鐵調素(Hepcidin)近幾年已成為國內外研究熱點,不僅因為鐵調素是體內降低鐵水平的“類激素”,還因為其在中風、炎癥和急性肝衰竭發病機制中存在許多重要影響作用[1-4]。鐵調素是機體鐵穩態的主要調節因子,它是由肝細胞分泌的含有25個氨基酸的肽類激素;鐵調素能夠通過降解腸道上皮細胞表面的鐵轉運蛋白和腸腔內鐵結合,抑制腸道對鐵的吸收,同時通過抑制腸道上皮細胞中的鐵轉運蛋白表達和功能,減少鐵的釋放進入血液循環[5]。

目前鐵調素與骨代謝的相關性主要為鐵蓄積是骨質疏松癥的獨立危險因素[6-7]。鐵調素的主要作用是在體內通過降鐵進而挽救骨量。同時鐵蓄積對成骨細胞增殖和分化存在顯著抑制作用,最終抑制骨形成[8-9]。因而,鐵調素作為體內影響鐵代謝的重要“類激素”,有許多關于“鐵調素-骨代謝”方面的研究:例如敲除小鼠體內鐵調素基因,小鼠骨量顯著減低[10-11];在斑馬魚中敲除鐵調素同樣表現出成骨抑制等[12]。這些研究多是聚焦于鐵調素通過發揮降鐵作用,促進骨量恢復?；阼F調素與骨代謝存在相關性的基礎研究結果,本研究旨在探討不同骨密度人群中鐵調素水平是否存在差異,鐵調素除“降鐵作用”外,是否具有獨立促進細胞成骨分化的作用,進而分析血清鐵調素指標是否在骨質疏松癥診療中具有臨床評估價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象及分組:收集蘇州大學附屬第二醫院骨科檢測過骨密度(DXA,雙能X線)的患者資料。納入標準:①年齡≥50歲絕經后女性;②有DXA檢查數據;③有總Ⅰ型膠原氨基末端前肽(P1NP)、I型膠原羧基末端肽(β-CTX)、25-羥基維生素D、甲狀旁腺素(PTH)和體質量指數(body mass index, BMI)等相關基線數據。排除標準:①患有骨骼系統疾病(骨腫瘤、骨骼細菌感染等);②屬于繼發性骨質疏松癥;③合并鐵代謝異常疾病。根據世界衛生組織在1994年確定的骨質疏松癥診斷標準,按骨密度T值將受試者分為兩組:①骨質疏松組:髖部和腰椎任一受檢部位T值≤-2.5;②骨量正常組:T值>-1.0。

1.1.2實驗材料:小鼠顱頂成骨前體細胞MC3T3-E1購自普諾賽生物科技公司(中國);鐵調素購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司(中國)。

1.1.3主要實驗試劑:α-MEM培養基(Gibco,美國);胎牛血清(Gibco,美國);胰蛋白酶(碧云天,中國);青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Invitrogen, 英國);β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C(Sigma,美國);CCK-8試劑盒(碧云天,中國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天,中國);RNA提取試劑盒(諾唯贊,中國);cDNA逆轉錄試劑盒(Takara,日本);SYBR Green Supermix(Takara,日本);RT-PCR引物(金唯智,中國);茜素紅檢測試劑盒(Solarbio,中國);BMP2抗體(abcam,美國);P-SMAD1/5(CST,美國);SMAD5(CST,美國);GAPDH抗體(Affinity,中國);人鐵調素ELISA試劑盒(酶聯生物,中國)。

1.1.4主要實驗儀器:CO2恒溫細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific,美國);多功能酶標儀(BioTek,美國);倒置相差顯微鏡(Carl Zeiss,德國);熒光定量PCR儀(ABI,美國);Western Blot成像系統(上海吉盛,中國)。

1.2 方法

1.2.1血清鐵調素蛋白水平檢測:收集兩組受試者血清,置于-80 ℃保存;運用ELISA試劑盒檢測鐵調素,標準曲線制備及樣品測定方法按照說明書操作;在450 nm波長處檢測OD值,根據標準曲線計算各孔濃度。

1.2.2CCK-8實驗:將MC3T3-E1細胞以5×107/孔的密度接種于96孔板中。將鐵調素重組蛋白溶于無菌PBS中。細胞分盤接種24 h后更換含有不同濃度鐵調素(0、1、5、10、50 ng/mL)的α-MEM培養基。細胞培養72 h后,加入CCK-8溶液并在細胞培養箱中孵育30 min。用酶標儀測定溶液在450 nm波長下的吸光度。

1.2.3RT-PCR實驗:將MC3T3-E1細胞以5×105/孔分盤接種于12孔板中,用含有不同濃度鐵調素(0、1、5、10 ng/mL)的成骨誘導培養基進行成骨分化7 d,按照試劑盒說明書提取細胞總RNA,逆轉錄cDNA后進行RT-PCR。采用 2-ΔΔCt法計算靶基因的表達水平,引物序列信息見表 1。

表1 各基因的引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4Western Blot:將MC3T3-E1細胞以5×105/孔接種于12孔板中,用含有不同濃度鐵調素(0、1、5、10 ng/mL)的成骨誘導培養基進行成骨分化7 d,用含有PI、PPI的RIPA緩沖液制備蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白在10 %聚丙烯酰胺膠中電泳,轉移到PVDF膜上轉膜2 h,室溫下使用5 %脫脂奶粉封閉1 h,用相應兔抗鼠一抗BMP2(1∶1 000)、P-SMAD1/5(1∶1 000)、SMAD5(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000), 4 ℃過夜,TBST洗膜,室溫下二抗(1∶5 000)孵育1 h。采用ECL化學發光法顯影,采用ImageJ軟件對各條帶灰度值進行定量測定。

1.3 統計學分析

統計分析均使用SPSS22.0版、GraphPad Prism 9.0版進行統計數據、R語言繪制圖表。計量數據符合正態分布方差齊,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用ANOVA分析?；赗語言,采用Pearson相關分析進行變量相關關系分析,利用隨機森林算法分析各變量對絕經后骨質疏松發病的重要性。P<0.05,認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般數據比較

本研究共入組73例,其中骨量正常組35例、骨質疏松組38例。兩組的年齡、身高、體重、BMI相比,未見明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 兩組間基礎指標比較Table 2 Comparison of basic indicators between two

2.2 骨代謝指標比較

兩組受試者總Ⅰ型膠原氨基末端前肽(P1NP)、I型膠原羧基末端肽(β-CTX)、25-羥基維生素D、甲狀旁腺素(PTH)之間比較未見明顯差異(P>0.05),見表3。

表3 兩組間骨代謝指標比較Table 3 Comparison of bone metabolism indicators between two

2.3 鐵調素水平比較

收集受試者血清進行分析,結果顯示,骨量正常組鐵調素水平顯著高于骨質疏松組(P<0.000 1),見圖1。

2.4 鐵調素和腰椎、髖部骨密度間的相關性

Pearson相關系數模型檢驗分析顯示,血清鐵調素濃度和髖部骨密度T值間呈現中度正相關性 (R=0.567 ,P<0.001),血清鐵調素濃度和腰椎骨密度T值間呈現中度正相關性(R=0.524 ,P<0.001),見圖2。

圖2 鐵調素和腰椎、髖部骨密度的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of hepcidin and bone mineral density of lumbar spine and hips

2.5 隨機森林算法評估

運用R語言的隨機森林算法進行分析,觀察誤差率(Error)隨決策樹數目(ntree)的變化情況(ntree值取400～600時誤差率趨于穩定)就可評估自變量對絕經后骨質疏松預測的重要性,見圖3。因本研究ntree選擇為400,得到最佳模型?；诖?根據各自變量通過隨機森林中的基尼系數,得到各項指標重要性排序。分析后發現鐵調素的基尼系數大于4,證明鐵調素在骨質疏松疾病的發生發展中具有重要的影響作用。

圖3 隨機森林算法評估自身指標在疾病預測中的作用

2.6 CCK-8檢測鐵調素對MC3T3-E1細胞的增殖作用

用不同濃度鐵調素(0、1、5、10、50 ng/mL)分別處理MC3T3-E1細胞72 h。結果顯示,鐵調素濃度在0～10 ng/mL對MC3T3-E1細胞增殖沒有明顯促進或抑制。當鐵調素濃度高于10 ng/mL時,對細胞的增殖具有顯著的抑制作用。見圖4。

圖4 鐵調素對MC3T3-E1細胞增殖的影響Fig.4 Effects of hepcidin on the proliferation in MC3T3-E1 cells

2.7 RT-PCR檢測MC3T3-E1成骨基因的表達

用含有不同濃度鐵調素(0、1、5、10 ng/mL)成骨誘導培養基誘導MC3T3-E1成骨分化7 d后,RT-PCR檢測成骨相關基因表達。結果顯示在5、10 ng/mL濃度時,鐵調素顯著上調了早期成骨基因ALP和Runx2的表達。見圖5。

圖5 鐵調素對MC3T3-E1細胞成骨分化相關基因轉錄水平的影響Fig.5 Effects of hepcidin on the translation expression of osteogenic differentiation related genes in MC3T3-E1 cells

2.8 蛋白質印跡法檢測成骨相關信號通路變化

通過Wester-Blot檢測鐵調素對成骨分化相關通路蛋白BMP2、P-SMAD1/5和SMAD5表達的影響。結果顯示,在濃度為5、10 ng/mL時鐵調素促進了成骨分化相關通路蛋白BMP2、P-SMAD1/5和SMAD5的表達。結果表明鐵調素通過激活BMP-SMAD通路來促進成骨分化。見圖6。

圖6 鐵調素對MC3T3-E1細胞成骨分化相關通路蛋白的表達Fig.6 Hepcidin regulates the expression of osteogenic differentiation-related pathway proteins in MC3T3-E1 cells

3 討論

在絕經后骨質疏松癥診療過程中,血清生物標志物可幫助醫生開展臨床評估。因此,近些年探索新的骨代謝相關指標研究越來越多。根據已有的動物、細胞實驗報道,鐵調素與骨量、骨代謝存在相關性[9,13-14]。但是骨質疏松癥人群血清鐵調素水平如何變化,鐵調素是否具有直接調控骨量的作用,目前尚無文獻報道。

本研究檢測了絕經后女性血清鐵調素水平,比較骨量正常、骨質疏松癥兩組鐵調素平均值,結果顯示骨質疏松癥組的鐵調素水平顯著低于骨量正常組,這一結果初步提示骨質疏松癥存在鐵調素水平降低現象。隨后分析了鐵調素與腰椎、髖部骨密度的相關性,結果顯示骨密度(腰椎及髖部)均隨體內鐵調素水平升高而增加;這提示體內鐵調素水平和骨量存在正相關關系,且這種相關性和鐵蓄積沒有關聯。本研究還檢測了絕經后女性其他血清骨代謝指標(P1NP、β-CTX、PTH、25OH-VitD),為比較鐵調素、P1NP、β-CTX、PTH、25OH-VitD與本研究組人群骨密度變化的相關性,筆者采用隨機森林算法進行自變量評估。結果顯示,當骨密度作為特征變量,在自變量中,鐵調素指標與骨密度相關性最顯著(基尼系數9.5)[15]。P1NP、β-CTX常常作為絕經后骨質疏松癥骨代謝高轉換評估指標,但患者個體差異較大,易收到藥物影響[16]。而本研究組的結果中,P1NP、β-CTX與骨密度相關性沒有鐵調素顯著。綜合本組研究結果,筆者認為,人群血清鐵調素與絕經后骨質疏松存在一定相關性,進一步開展多中心、連續年齡等臨床研究對了解鐵調素作為絕經后骨質疏松癥的評估指標有較好的臨床意義。

已有研究認為鐵調素在肝臟的表達是通過BMP2-SMAD信號通路進行調控的,BMP與肝細胞膜上的BMP受體結合,該受體磷酸化胞漿SMAD,這些SMAD易位至與SMAD4復合的細胞核,進而激活鐵調素基因的轉錄 ;鐵調素是目前發現的唯一在鐵穩態中負性調節因子,其降鐵作用非常明確[9,17]。鐵調素與鐵螯合劑(DFO)在鐵蓄積狀態的骨代謝研究中,除了降低體內鐵蓄積作用之外,還存在刺激血管內皮生長因子(VEGF)、提高缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達、促進骨骼的血管生長等作用[18-19]。另外,鐵調素直接干預研究也比較有意義。Li 等[20]研究認為鐵調素缺乏可通過FOXO3a干擾Wnt/β-catenin通路導致骨量丟失;Guo等[21]研究認為鐵調素可促進破骨前體細胞增值和分化,在骨穩態中有負性調節作用;Ma 等[22]研究認為鐵調素基因敲除小鼠可呈現低骨量表型。因此,目前研究顯示鐵調素在骨穩態中有比較明顯作用,但在骨形成、骨吸收過程中的確切功能仍有待進一步研究。

本研究的細胞實驗中,筆者考慮鐵調素肝臟表達主要由BMP-SMAD通路調控 ;同時考慮在骨骼代謝中,BMP2是骨基質中必須生長因子,且BMP-SMAD信號通路可調控下游靶基因促進骨細胞形成[23]。因此,采用鐵調素干預成骨前體細胞,希望了解鐵調素是否可能通過反饋機制進而激活BMP-SMAD信號通路促進成骨細胞活性。細胞實驗結果顯示,低濃度的鐵調素可以促進成骨前體細胞(MC3T3-E1)骨形成;與對照組相比,加入低濃度的鐵調素重組蛋白的MC3T3-E1細胞在mRNA層面呈現更高水平的ALP和Runx2表達,成骨活性增加;另一方面,在MC3T3-E1細胞中加入低濃度的鐵調素重組蛋白,與對照組相比,細胞的BMP2、P-SMAD1/5和SMAD蛋白表達量顯著增加。這些結果表明,鐵調素可能通過調節BMP2-SMAD通路活性,進而促進MC3T3-E1細胞成骨分化。

綜上,本研究發現人群血清鐵調素水平和骨量呈正相關,成骨前體細胞實驗提示鐵調素可能通過激活BMP2-SMAD1/5信號通路促進成骨分化。本次研究結果初步說明鐵調素水平與絕經后骨質疏松癥相關,也為進一步探討鐵調素作為臨床評估指標提供了部分實驗依據。