成骨分化中的鐵死亡在骨質疏松發病機制中的研究

劉祥輝 彭國璇 彭洪成 林圓 曾令云 雷安毅 黃明智,*

1.貴州醫科大學,貴州 貴陽 550025

2.貴州醫科大學附屬醫院,貴州 貴陽 550004

骨組織是一種活躍的代謝組織,它通過持續的重建來維持其礦化平衡及自身的結構完整。在骨重建周期中,成骨細胞與破骨細胞分別誘導的骨形成和骨吸收緊密耦合。骨重建功能障礙則常常引發包括骨丟失、骨硬化等多種疾病,如骨質疏松癥(osteoporosis,OP)、骨硬化癥和Paget’s骨病。OP是以骨量減少,骨質量受損及骨強度降低,導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病[1]。隨著我國逐步步入老齡化社會,OP的患病率呈現明顯的上升趨勢。據相關流行病學調查顯示,我國50歲以上人群OP患病率為19.2%,其中男性為6.0%,女性為32.1%;65歲以上人群OP患病率為32.0%,其中女性為51.6%,男性為10.7%[2]。OP已成為中國公共衛生的一個重要問題。

鐵是一種人體必需的微量元素之一,它在氧氣的運輸和儲存、線粒體功能以及酶的活性中都起著至關重要的作用。早在2012年,哥倫比亞大學Dixon等[3]發現一種Ras選擇性致死化合物,即erastin,該化合物可以特異性誘導Ras突變細胞死亡,區別于細胞凋亡、壞死、自噬等死亡方式,這種新的細胞程序性死亡具有鐵離子依賴性,稱之為鐵死亡。隨著研究的廣泛展開,研究者們已發現鐵死亡在神經系統疾病、心臟疾病、肝臟疾病、胃腸道疾病、肺部疾病、腎臟疾病、胰腺疾病等多種系統疾病中發揮著重要作用[4]。此外,相關研究還證實了鐵過載和鐵死亡在調節成骨分化方面發揮了關鍵作用。這些發現進一步加深了對鐵死亡機制的理解,并揭示了其在骨骼健康和骨代謝方面的重要性。本文擬從鐵死亡發生機制及其在成骨分化中的作用研究展開論述,旨在為OP的臨床治療提供理論依據。

1 鐵死亡

1.1 鐵代謝與鐵死亡

在人體內,鐵離子以Fe2+的形式被小腸吸收或從血紅素中釋放,然后被氧化為Fe3+。接著,攜帶Fe3+的轉鐵蛋白(transferrin,Tf)會與質膜上的轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1)結合。質膜形成囊泡以吸收攜帶Fe3+的Tf進入細胞,然后囊泡中的低pH誘導Fe3+從Tf中被剝離。脫落的Fe3+被前列腺六跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3)還原為Fe2+,然后通過二價金屬離子轉運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)介導Fe2+釋放到細胞內不穩定鐵池(labile iron pool,LIP)[5]。過量的Fe2+會被轉運到細胞外,并儲存在鐵蛋白中。生理狀態下,鐵蛋白以惰性形式儲存細胞內鐵,其惰性狀態不能促進脂質過氧化[6]。而當核受體共激活因子4(nuclear receptor co-activator 4,NCOA4)介導的鐵蛋白自噬降解(鐵蛋白吞噬)釋放大量Fe2+時,就會增加細胞不穩定的鐵含量,從而誘發鐵過載[7]。鐵過載狀態下,LIP中過量的Fe2+可通過芬頓反應(Fenton reaction)和哈伯-韋斯反應(Haber-Weiss reaction)產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),從而誘發鐵死亡[8]。系統調節鐵離子的主要因素是鐵調素(Hepcidin),這是一種由肝臟分泌產生的鐵調節激素[9]。鐵調素會與膜鐵轉運蛋白1(ferroportin 1,FPN1)結合,通過引起其內化來降低其活性,導致細胞鐵的輸出減少,減輕組織鐵過載[10]。細胞內鐵離子的調節則取決于鐵調節蛋白(iron regulatory protein,IRP)/鐵反應元件(iron response element,IRE)系統。當鐵缺乏時,活躍的IRP會與IRE結合,這會增加鐵的吸收和利用[11]。這一機制可以維持人體內環境及細胞內的鐵穩態。

近期,Yang等[12]發現內皮細胞分泌的外泌體(endothelial cell-secreted exosomes,EC-Exos)可以通過抑制鐵蛋白自噬降解導致的鐵過載來降低鐵死亡對細胞造成的損傷程度,逆轉了糖皮質激素對成骨細胞的成骨抑制作用。因此,鐵蛋白吞噬釋放鐵而導致的鐵過載可能是鐵死亡的必要條件。去鐵胺(Deferoxamine,DFO)是一種鐵螯合劑,也可以抑制細胞內鐵過載引起的鐵死亡[13]。此外,Brown等[14]的研究發現,參與脂質動力學調節的五跨膜蛋白prominin2蛋白可以促進含鐵蛋白的多泡體(multivesicular bodies,MVB)和外泌體的形成,這些外泌體將鐵轉運出細胞,抑制鐵死亡。

1.2 鐵死亡中的脂質過氧化

谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)被認為是調節細胞鐵死亡的一種關鍵分子,其主要作用是將還原型谷胱甘肽轉化為氧化型谷胱甘肽,并將細胞毒性LPO(L-OOH)還原為相應的醇類(L-OH)。谷胱甘肽由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成的抗氧化劑,以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的形式廣泛存在于細胞中[15]。其在氧化應激反應中發揮重要的作用。一種由兩個亞基SLC7A11和SLC3A2以二硫鍵連接的異二聚體-胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(cystine/glutamate antiporter,system Xc-)將細胞外胱氨酸轉運到細胞內,并進一步將其轉化為半胱氨酸,然后用于谷胱甘肽的生物合成,以維持氧化還原穩態[16-17]。Jiang等[18]研究發現,p53蛋白可通過抑制system Xc-的關鍵成分SLC7A11的表達,抑制胱氨酸攝取并使細胞對鐵死亡敏感。GPX4不足導致LPO產生過多,而LPO則是細胞鐵死亡的直接執行者。相關研究證實鐵死亡誘導劑磷酸化酶激酶G2可調節脂氧合酶(lipoxygenases,LOX)活性,進而通過抑制GPX4活性,促進多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)的過氧化來驅動鐵死亡,表明PUFA可能是鐵死亡細胞脂質過氧化的重要靶點[19]。?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)和LOX是促進脂質過氧化和鐵死亡的兩種核心酶。ACSL4對于含多不飽和脂肪酸的磷脂(polyunsaturated fatty acid-containing phospholipids,PUFA-PL)的生成至關重要。具體來說,ACSL4負責將輔酶A酯化為游離脂肪酸,尤其是對花生四烯酸(arachidonoyl,AA)和腎上腺素酰(adrenoyl,AdA)等長鏈PUFA的生成有明顯的促進作用。隨后,ACSL4進一步促進AA和AdA酯化生成磷酯酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)[20-21]。生成的PEs可被LOX催化氧化,產生磷脂氫過氧化物和包括4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)在內的活性醛。4-HNE和MDA是顯著的毒性產物,可與DNA堿基、蛋白質和其他親核分子反應,導致嚴重的細胞毒性[22]。

2 成骨細胞鐵死亡與OP

2.1 成骨細胞鐵死亡

成骨細胞通過合成多種骨基質蛋白在骨形成中發揮核心作用。早期研究表明,鐵過載通過減少成骨細胞增殖和分化而出現明顯的骨重建抑制,并引發OP[23],這進一步支持了“鐵蓄積”假說,即高鐵水平是OP的危險因素。隨后的研究發現氧化應激引起的成骨細胞功能障礙在OP的病理生理學中也起著重要作用。通過降低成骨細胞氧化應激水平,可促進其生長并減輕OP的發展[24]。隨后又有相關研究報導鐵可能是通過細胞內鐵濃度增加而導致更高的氧化應激水平,從而抑制成骨細胞的功能[25]。Zhao等[26]發現,白藜蘆醇逆轉過量鐵所致的骨形成障礙是通過上調轉錄因子FOXO1的水平,維持小鼠體內氧化還原水平所實現的。Tao等[27]發現,水飛薊賓可以抑制鐵過載的不良影響,并通過改變骨代謝和氧化應激水平來促進成骨細胞的增殖和分化,并增加其堿性磷酸酶的分泌和礦化能力。這些實驗表明減輕成骨細胞氧化應激水平可以減輕鐵過載對其的活性抑制。

過量鐵與氧化應激導致的成骨細胞活性下降與鐵死亡的機制不謀而合。隨后的研究也證實了過量的鐵積累以及氧化應激會誘導成骨細胞的鐵死亡,損害其功能,最終導致OP的發生。例如,Jiang等[28]通過實驗證明鐵過載誘導MC3T3-E1細胞(小鼠胚胎成骨細胞前體細胞)的鐵死亡,從而抑制了MC3T3-E1細胞的體外成骨分化和礦化。Zhang等[29]的研究發現NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)位點包含IRE序列,這些序列通常被IRP蛋白結合并抑制,與鐵結合誘導IRP從IRE序列上解離,從而激活NOX4轉錄。NOX4升高增加脂質過氧化物積累。因此,過量鐵積累可引起NOX4在骨骼積累,造成成骨細胞鐵死亡以及隨后OP的發生。此外,另一項近期的研究發現地塞米松通過抑制SLC7A11和GPX4的表達,誘導p53表達升高,從而降低細胞內谷胱甘肽等細胞內抗氧化系統的活性,使MC3T3-E1細胞出現一系列鐵死亡征象[30]。Zhu等[31]發現高脂肪飲食導致小鼠股骨骨質流失,隨后他們研究發現高脂肪飲食主要影響骨髓腔中幼稚型成骨細胞增殖和成骨分化導致骨質流失,鐵死亡抑制劑則會抑制這種影響,這表明高脂肪飲食可能通過成骨細胞鐵死亡引起骨質流失。并且晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)也可以通過誘導成骨細胞鐵死亡來破壞成骨細胞的功能,從而促進OP[32]。近期有研究者發現高糖和高脂肪誘導的成骨細胞鐵死亡可能是通過激活METTL3/ASK1-p38信號通路導致糖尿病性OP[33]。而激活轉錄因子3(activating transcription factor3,ATF3)則可通過介導system Xc-的活性抑制誘導高糖條件下的成骨細胞鐵死亡[34]。此外,Wang等[35]也通過研究發現谷胱甘肽代謝和鐵死亡途徑中的GSTM1基因和TFRC基因在成骨細胞的正常分化和廢用性OP發病機制過程中起重要作用。這些研究表明各種類型OP的發生可能與成骨細胞中鐵穩態失衡和鐵死亡有關。

2.2 成骨細胞鐵死亡與OP發生發展

通過抑制鐵過載和(或)LPO積累可抑制成骨細胞鐵死亡,從而改善OP癥狀的研究表明抑制成骨細胞鐵死亡可能在治療OP中發揮重要作用。例如,Valanezhad等[36]發現Ferrostatin-1(一種腫瘤細胞鐵死亡抑制劑)對erastin誘導的MC3T3-E1細胞鐵死亡具有抑制作用。線粒體是細胞內氧化還原的重要場所,在鐵死亡發生過程中起到十分重要的作用。鐵可以通過線粒體外膜和線粒體內膜到達線粒體基質,隨后調節線粒體的生理功能[37]。線粒體鐵蛋白(mitochondrial ferritin,FtMt)則是一種存在于線粒體內的亞鐵氧化酶,其可將鐵儲存在線粒體中并限制Fe2+和過氧化氫之間發生的芬頓反應,從而降低細胞內氧化應激反應。在生理條件下,FtMt調節線粒體中的游離鐵含量,維持正常的線粒體鐵代謝。FtMt過表達可以逆轉erastin誘導的鐵死亡[38]。隨后,Wang等[39]發現FtMt過表達通過減少過量Fe2+引起的氧化應激,可減少高糖條件下的成骨細胞鐵死亡。Xu等[40]發現維生素D受體激活劑1,25-二羥維生素D3可以通過激活維生素D受體及其下游核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/GPX4信號通路,導致脂質過氧化作用下調,從而減弱成骨細胞鐵死亡。此外,研究還發現,過表達SIRT6(沉默信息調節蛋白的一種)可以通過抑制地塞米松誘導的成骨細胞鐵死亡的發生,保護成骨細胞活性,促進成骨細胞分化[41]。Lu等[42]的研究則發現骨髓來源的內皮祖細胞中提取的細胞外囊泡(extracellular vesicles extracted from bone marrow-derived endothelial progenitor cells,EPC-Evs)增加了類固醇誘導的OP小鼠模型骨小梁骨和骨髓的體積和密度,并通過生物信息學分析出EPCs-EVs能夠逆轉地塞米松誘導的氧化損傷標志物增加。

隨著相關研究的不斷展開,已經發現了一些物質可以通過抑制成骨細胞的鐵死亡來治療OP。常見的像褪黑素(whether melatonin,MT),這是一種由腦松果體分泌的激素之一。Ma等[43]研究發現,MT可抑制Nrf2和c-JUN轉錄因子之間的相互作用,從而降低下游血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)啟動子活性。而HO-1可催化血紅素氧化釋放大量不穩定的游離鐵,進而催化芬頓反應形成脂質過氧化物。因此,MT正是通過抑制Nrf2/HO-1信號通路抑制成骨細胞的鐵死亡,從而改善體內外骨微結構。Luo等[44]研究發現,Wnt激動劑、鐵死亡抑制劑或抗氧化劑MT在鐵過載的下游發揮作用,減少ROS和LPO的產生來恢復成骨細胞分化,從而在不減少鐵過載的情況下防止鐵死亡。此外,一些中草藥中含有的物質也被發現具有抗OP的作用。例如,Lin等[45]從知母中分離得到阿拉伯甘露聚糖(PAAP-1B),其由阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖組成。PAAP-1B通過降低4-HNE、MDA、線粒體活性氧化物質水平和脂質過氧化來抑制成骨細胞的鐵死亡,并且減輕了糖尿病性OP中SLC7A11和谷胱甘肽表達的下調。另一項研究發現,青娥丸(Qing-e Pill,QEP)可以通過PI3K/AKT通路和ATM通路抑制鐵死亡,促進成骨細胞存活,對OP有治療作用[46]。見圖1。

圖1 成骨細胞鐵死亡的機制及調控Fig.1 Mechanism and regulation of ferroptosis in osteoblasts

3 骨髓間充質干細胞鐵死亡與成骨分化

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類具有自我更新及多向分化潛能的干細胞,也是成骨細胞的主要來源。然而,一些研究表明鐵和鐵蛋白能夠特異性抑制BMSCs的成骨定型和分化[47]。Lu等[48]的研究發現,鐵調素可以增強BMSCs成骨分化和礦化,表現為分化標志物堿性磷酸酶和成骨基因的上調。Apelin是一種由脂肪細胞分泌的內源性脂肪因子。Chen等[49]發現Apelin可以激活BMSCs的有絲分裂,改善其氧化應激水平,通過AMPK-α的磷酸化促進BMSCs的成骨分化?？顾ダ现胁菟廃S芪的主要活性成分黃芪多糖被發現可減弱檸檬酸鐵銨誘導的鐵過載導致的BMSCs增殖抑制,并且黃芪多糖處理抑制了檸檬酸鐵銨處理的BMSCs細胞內和線粒體ROS水平的增加[50]。這些實驗的結果表明鐵過載和氧化應激可降低BMSCs的增殖活性及成骨分化能力。近期的研究也證實了抑制BMSCs鐵死亡可以增強其增殖活性及分化能力。例如,Li等[51]發現MT可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路來抑制BMSCs的鐵死亡,從而減少類固醇性OP的發生。此外,研究發現槲皮素和生育酚也可通過PI3K/AKT/mTOR通路抑制BMSCs鐵死亡,從而保護BMSCs免受氧化應激損傷,恢復其成骨能力[52-53]。黃杞苷則可通過Nrf2/Keap1抗氧化途徑減少BMSCs中ROS以及LPO的積累,減輕氧化損傷,防止鐵死亡的發生,并促進BMSCs的成骨分化[54]。依布硒是一種具有谷胱甘肽過氧化物酶樣活性的抗氧化劑,可改善脂多糖誘導的BMSCs鐵死亡和成骨抑制[55]。近期的一項研究還發現,維生素K2可以減輕高糖引起的BMSCs鐵死亡,起到改善2型糖尿病性OP的作用[56]?？偟膩碚f,這些研究表明鐵死亡會降低BMSCs活性,影響其成骨能力,進而影響骨重建,導致OP的發生。

外泌體是一種微小的細胞外囊泡,其內部包括了特定蛋白、mRNA、microRNA和lncRNA等物質。外泌體可由多種類型的細胞釋放,其細胞信息交換在疾病的發生發展中尤為重要。最近的研究表明,BMSCs來源的外泌體(MSCs-derived exosomes,MSC-Exos)及其內含的非編碼RNA可能在調控骨相關活性中起到重要作用。例如,研究人員發現MSC-Exos中過表達的microRNA-130a、microRNA-140-3p和miR-129-5p增加了BMSCs的成骨分化并減弱了其成脂分化[57-59]。Zhao等[60]研究發現,MSC-Exos可通過MAPK途徑促進成骨細胞增殖,從而改善OP。Yang等[61]發現,MSC-Exos內含的lncRNA-MALAT1通過介導micRNA-34c/SATB2軸增強OP小鼠的成骨細胞活性。Zhang等[62]發現,MSC-Exos攜帶microRNA-935并通過靶向信號轉導及轉錄激活因子1促進成骨細胞的增殖和分化。近期的一些研究還報導了MSC-Exos中的非編碼RNA在心肌細胞、小膠質細胞和肝細胞中通過調控鐵死亡的方式,在心血管系統、神經系統以及消化系統疾病的預防和治療中發揮重要作用[63-65]。綜合考慮microRNA可能通過影響成骨細胞的氧化應激水平,從而改變其增殖和分化功能的相關研究[66-67],假想某些MSC-Exos可能通過影響成骨細胞的鐵死亡,來發揮抗OP的作用。見表1。

表1 成骨細胞或BMSCs鐵死亡的干預措施及其機理Table 1 Intervention measures and mechanism of ferroptosis in osteoblasts or BMSCs

4 展望與總結

鐵死亡相關機制目前仍待進一步深入研究,然而隨著鐵死亡方面研究的不斷涌現,已經表明鐵死亡在OP的發病機制中發揮重要作用。其中成骨分化中鐵死亡的相關研究尤為值得關注。越來越多的研究表明成骨細胞鐵死亡可能是影響OP發病機制的重要影響因素。那么如何抑制成骨分化中鐵死亡的研究就顯得十分重要。目前,一些中草藥成分對抑制成骨分化中的鐵死亡以及改善OP的作用機制的研究已經部分闡明,這為OP的治療提供了一些理論依據。此外,一些外泌體中非編碼RNA在骨相關細胞鐵死亡中發揮著重要作用,這預示著靶向非編碼RNA可為OP提供一個新的潛在治療靶點。本文總結了鐵死亡的部分機制,以成骨分化中的鐵死亡為切入點,闡明了抑制成骨分化中的鐵死亡可能成為OP防治的重要途徑,并為后續有關鐵死亡與OP的研究提供了思路。