牛至香酚對LPS免疫應激小鼠血清細胞因子含量和腸道細胞因子、緊密連接蛋白表達水平的影響

呂明其, 陳穎清, 吳曉晴, 李 健, 廖呂燕, 吳樟強, 黃一帆, 馬玉芳

[1.重慶醫科大學實驗教學管理中心,重慶 400016;2.中西獸醫結合與動物保健福建省高等學校重點實驗室,福建 福州 350002;3.福建省獸醫中藥與動物保健重點實驗室(福建農林大學),福建 福州 350002;4.福建省中農牧生物藥業有限公司,福建 龍巖 364099]

牛至味辛、性涼,有清熱解表、理氣化濕和利尿消腫之功效,曾收載于《中華人民共和國藥典》(1977年版)中[1]。牛至香酚是從牛至中提取的一種揮發性植物精油,主要成分有百里香酚、香芹酚、γ-萜品烯和p-異丙甲苯等酚類化合物[2-3]。研究表明,牛至香酚有促生長[4-5]、增強機體免疫力[6-7]、抗氧化[8]和抗腫瘤[9]等功效。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)為革蘭氏陰性菌膜結構物質,是一種內毒素,能通過靶細胞上的Toll樣受體的信號轉導作用激活單核、巨噬細胞漿內核轉錄因子κB,使炎性介質大量釋放引起內毒素積聚造成腸道上皮細胞受損、腸道通透性增強[10-11]。本課題組前期研究表明,牛至香酚能通過調節免疫應激小鼠脾臟核轉錄因子和細胞因子mRNA的表達水平,減輕LPS對脾臟造成的免疫應激損傷[12]。但牛至香酚對免疫應激小鼠腸道細胞因子和緊密連接相關跨膜蛋白、胞質附著蛋白mRNA表達水平的影響卻鮮見報道。據此,本研究探討牛至香酚對LPS免疫應激小鼠血清細胞因子含量和腸道細胞因子、緊密連接蛋白mRNA表達水平的影響,旨在探討牛至香酚對LPS免疫應激小鼠的免疫調節機理,豐富牛至香酚免疫藥理學內容,為其進一步的開發應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 健康雄性清潔級昆明(KM)小鼠體質量(22±2) g,購自福建醫科大學實驗動物中心。動物試驗通過了福建農林大學學術委員會動物實驗倫理審查(審批號:PZCASFAFU21008) 。

1.1.2 試劑 牛至香酚由福建省中農牧生物藥業有限公司惠贈,其中,百里香酚和香芹酚的含量為67%;注射用LPS購自Sigma公司;ELISA試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1.1.3 儀器與設備 主要儀器與設備有獨立送回風凈化籠具(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)、電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]、SW-CJ-1F型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、ALLEGRA X-22R型冷凍離心機(美國貝克曼公司)、CFX96型實時熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)、SK-1快速混勻器(金壇市科析儀器有限公司)。

1.2 試驗動物分組與處理

將80只小鼠適應性飼養1周后隨機分成5組,分別為空白對照組,模型組和牛至香酚低、中、高劑量組,每組16只。所有小鼠均自由飲水、采食。牛至香酚低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg·kg-1的劑量灌胃牛至香酚,空白對照組和模型組按10 mL·kg-1的劑量灌胃橄欖油,每日1次,連續14 d。第15天時,牛至香酚試驗組和模型組均按8 mg·kg-1的劑量腹腔注射LPS,空白對照組注射等量生理鹽水。

1.3 樣品采集與處理

腹腔注射LPS 6 h后,將小鼠的眼球摘去并采集血液,分離血清;采用頸椎脫臼法處死小鼠,將取出的回腸和結腸組織裝入經DEPC水處理后的Eppendorf管中,置于-80 ℃凍存備用。

1.4 小鼠血清細胞因子含量的檢測

采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的含量。

1.5 小鼠腸道細胞因子和緊密連接蛋白mRNA表達水平的RT-PCR檢測

采用RT-PCR檢測小鼠回腸和結腸組織細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β)和緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1)mRNA的相對表達量。

1.5.1 RNA的提取 將腸道組織放入1.5 mL去酶管中,于冰上研磨,加入1 mL RNAiso Plus,混勻后用離心管分裝為兩管,室溫下靜置5 min;向每個離心管中加入200 μL氯仿,振蕩至液體乳化呈乳白色,室溫下靜置3 min后于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min;將上清液轉移至新的離心管中,加入等體積的異丙醇,室溫下靜置10 min;于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀,于4 ℃、7 500 r·min-1離心5 min,棄上清液。RNA沉淀在室溫下放置干燥后,加入20 μL Rnase Free dH2O溶解RNA,測定RNA的濃度和純度。

1.5.2 反轉錄 反轉錄體系為:2 μL 5×Prime Script Buffer、0.5 μL Rimescript RT Enzyme Mix×1、0.5 μL Ligo dT Primer(50 μmol·L-1)、0.5 μL Andom 6 Mers(10 μmol·L-1)、1 μL Total RNA、5.5 μL Rnase Free dH2O。反轉錄程序為:37 ℃,15 min(反轉錄反應);85 ℃,5 s(反轉錄酶失活反應);4 ℃下保存。

按照cDNA反轉錄試劑盒說明書的步驟將提取的RNA反轉錄成cDNA,按照SYBR Premix EXTaqTM試劑盒說明書的步驟測定腸道細胞因子和緊密連接蛋白mRNA的相對表達量。

1.5.3 RT-PCR檢測 RT-PCR反應體系為:0.25 μL正向引物、0.25 μL反向引物、6.25 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1 μL cDNA、4.75 μL滅菌蒸餾水。擴增條件為:95 ℃預變性120 s;95 ℃變性5 s,62 ℃退火30 s,38個循環;65 ℃延伸5 s。經過相應條件擴增后,以β-actin為內參基因,每個樣本進行3次重復。采用相對定量法測得樣品的Ct值,采用2-ΔΔCt法計算各因子mRNA的相對表達量。引物序列及擴增長度如表1所示。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 RT-PCR引物序列及擴增長度Table 1 RT-PCR primer sequence and product size

1.6 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示;采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析;采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠血清細胞因子含量的影響

由表2可知,與空白對照組相比,模型組小鼠血清IL-6含量極顯著上升(P<0.01),IL-1β、TNF-α含量上升(P>0.05)。表明LPS導致小鼠機體炎癥因子含量增加,造成炎性損傷。與模型組相比,牛至香酚試驗組小鼠血清IL-6含量極顯著下降(P<0.01),IL-1β含量顯著下降(P<0.05);牛至香酚中、高劑量組IL-10含量顯著上升(P<0.05);牛至香酚高劑量組TNF-α含量極顯著下降(P<0.01)。表明牛至香酚可有效抑制LPS所致的致炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達,減輕機體炎癥反應。

表2 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠血清細胞因子含量的影響1)Table 2 Effect of oregano phenol on serum cytokine levels in mice with LPS-induced immune stress ρ/(ng·mL-1)

2.2 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠回腸組織細胞因子mRNA表達水平的影響

由表3可知,與空白對照組相比,模型組小鼠回腸組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平極顯著上調(P<0.01),IL-10 mRNA表達水平顯著上調(P<0.05)。表明LPS導致回腸端炎癥因子表達水平增高,造成回腸炎性損傷。與模型組相比,牛至香酚低、中劑量組小鼠回腸組織IL-1βmRNA表達水平極顯著下調(P<0.01);牛至香酚試驗組IL-6 mRNA表達水平極顯著下調(P<0.01);牛至香酚低劑量組TNF-αmRNA表達水平顯著下調(P<0.05),牛至香酚中、高劑量組TNF-αmRNA表達水平極顯著下調(P<0.01);牛至香酚中劑量組IL-10 mRNA表達水平極顯著上調(P<0.01);其余指標無統計學差異(P>0.05)。表明牛至香酚能減輕回腸端LPS造成的炎性損傷,降低炎性因子mRNA的表達水平。

表3 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠腸道組織細胞因子mRNA相對表達量的影響1)Table 3 Effect of oregano phenol on mRNA expression of intestinal cytokine in mice with LPS-induced immune stress

2.3 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠結腸組織細胞因子mRNA表達水平的影響

由表3可知,與空白對照組相比,模型組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達水平極顯著上調(P<0.01)。表明LPS導致結腸端炎性細胞因子增多,造成結腸炎性損傷。與模型組相比,牛至香酚試驗組IL-1βmRNA表達水平極顯著下調(P<0.01);牛至香酚低劑量組IL-6 mRNA表達水平顯著下調(P<0.05);牛至香酚中、高劑量組IL-10 mRNA表達水平極顯著上調(P<0.01);牛至香酚低、高劑量組TNF-αmRNA表達水平極顯著下調(P<0.01)。表明牛至香酚能有效減輕LPS所致的結腸炎性損傷。

2.4 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠回腸組織緊密連接蛋白mRNA表達水平的影響

由表4可知:模型組小鼠回腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表達水平與空白對照組相比無統計學差異(P>0.05);與模型組相比,牛至香酚中、高劑量組ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表達水平極顯著上調(P<0.01)。表明牛至香酚能修復LPS所致的回腸黏膜通透性損傷。

表4 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠腸道組織緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響1)Table 4 Effect of oregano phenol on mRNA expression of intestinal tight junction protein in mice with LPS-induced immune stress

2.5 牛至香酚對LPS免疫應激小鼠結腸組織緊密連接蛋白mRNA表達水平的影響

由表4可知:與空白對照組相比,模型組小鼠結腸組織Occludin、Claudin-1 mRNA表達水平極顯著下調(P<0.01);ZO-1 mRNA表達水平下調,但無統計學差異(P>0.05)。表明LPS通過引發腸道炎癥,導致結腸黏膜屏障發生改變。與模型組相比,牛至香酚試驗組ZO-1 mRNA表達水平有所上調,但差異不顯著(P>0.05);牛至香酚低劑量組OccludinmRNA表達水平顯著上調(P<0.05),牛至香酚中、高劑量組OccludinmRNA表達水平極顯著上調(P<0.01);牛至香酚高劑量組Claudin-1 mRNA表達水平極顯著上調(P<0.01)。表明牛至香酚能減輕結腸炎癥損傷,提高結腸黏膜的通透性。

3 討論

LPS誘發動物機體器官障礙綜合征初見于腸道[13],通過誘導腸道上皮細胞發生炎癥,破壞腸道屏障造成腸道通透性增強,內毒素更易透過腸道黏膜在腸道集聚導致炎性因子表達增多進而加重炎癥反應[14]。

本研究結果表明,牛至香酚能下調LPS免疫應激小鼠回腸和結腸組織致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達水平,上調抗炎因子IL-10 mRNA的表達水平。這與LPS導致小鼠血清細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量減少,IL-10含量增多的結果一致。與空白對照組相比,模型組小鼠回腸和結腸組織致炎因子分泌顯著增多,且牛至香酚能降低LPS引發的IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表達水平,表明LPS誘導模型成功,不同劑量的牛至香酚均能緩解小鼠機體中LPS誘導的炎癥反應。此結果與胡宇聲[15]、常軼聰[16]的研究結果相似。胡宇聲[15]研究表明,苦參露能通過抑制大鼠小腸上皮細胞和微血管內皮細胞TLR4、NF-κB信號通路的激活從而減少IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,緩解LPS誘導的炎癥對小腸的損傷作用;常軼聰[16]研究表明,二氫楊梅素能緩解LPS引起的雞腸道組織IL-6、TNF-αmRNA的表達水平。本研究中,牛至香酚試驗組小鼠回腸和結腸組織炎癥因子的表達水平與模型組相比存在不同的差異顯著性,由于不同腸段組織對于同一來源LPS所引發的炎癥反應存在差異,對不同劑量牛至香酚的耐受程度也不相同。牛至香酚試驗組小鼠結腸組織IL-10 mRNA的表達水平高于模型組,致炎因子mRNA的表達水平均下調,表明在Treg細胞炎性反應中通過分泌IL-10反向調節從而起到抑制炎癥的作用。中劑量牛至香酚能顯著或極顯著下調小鼠回腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達水平,上調IL-10 mRNA的表達水平,這與本課題組前期的研究結果[12]和惠永崗等[17]的研究結果相似。本課題組前期研究表明,牛至香酚能有效下調LPS免疫應激小鼠脾臟TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達水平,上調IL-10 mRNA的表達水平[12];惠永崗等[17]研究表明,葡萄糖-胰島素-鉀極化液(GIK)試驗組小鼠脾臟IL-10的表達水平高于模型組,IL-1β、TNF-α的表達水平低于模型組。前人研究還表明:香芹酚能下調大鼠肺臟組織TNF-α、IL-1β、IL-4的表達水平[18-19];百里香酚與迷迭香酸組合能顯著降低大鼠空腸黏膜IL-6的表達水平,降低TNF-α的表達水平,顯著提高IL-10的表達水平[20]。上述前人研究結果[18-20]與本研究結果相一致。本研究中,牛至香酚對小鼠血清和腸道促炎因子、抗炎因子的分泌產生作用,表明牛至香酚能通過降低IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表達水平進而干預NF-kB信號通路。這可能是因為牛至香酚含有的百里香酚可調控NF-kB信號通路進而產生抗炎的功效[21-24];牛至香酚含有的香芹酚能抑制LPS誘導的致炎因子的產生與釋放[25]。

腸道黏膜上皮細胞是腸腔內側的單層細胞,是阻止病原微生物和內毒素進入機體的一道重要防線[26]。應激和損傷會破壞腸道黏膜屏障,此時腸道病原微生物異常增殖、毒素大量積聚,病原微生物和內毒素透過受損的腸道黏膜屏障進入機體引發全身性炎癥反應。因此,腸道上皮細胞的增殖對維持腸道屏障的完整性十分重要[27]。研究表明,蛋白的功能主要取決于蛋白的相應結構[28],腸道緊密連接蛋白具有電荷選擇性,是構建黏膜上皮細胞屏障的重要結構。Claudin和Occludin為跨膜蛋白。Claudin具有調節屏障結構和轉運的功能,主要反映腸道上皮緊密連接的結構和功能狀態;Occludin直接構建緊密連接的柵欄和屏障。研究表明,內毒素可通過調節炎癥因子的表達水平從而影響ZO-1、Claudin、Occludin的表達水平,緊密連接蛋白的低表達水平導致腸道上皮細胞的屏障功能受損[29-32]。本研究結果表明,牛至香酚通過上調小鼠回腸和結腸組織ZO-1 mRNA的表達水平,修復LPS引發的腸道黏膜的屏障損傷。這與大黃素聯合黃芩苷[33]及0.05%和0.1%二氫楊梅素[16]能上調ZO-1表達水平的結果相一致。本研究中,與空白對照組相比,模型組小鼠回腸組織OccludinmRNA的表達水平上調,表明LPS可能通過影響Occludin的轉錄后修飾破壞腸道上皮細胞屏障緊密連接的完整性,增強腸道通透性,導致炎癥因子更容易通過腸壁進入體內;與空白對照組相比,模型組小鼠結腸組織Occludin、Claudin-1 mRNA的表達水平極顯著下調,表明LPS引發炎癥因子高表達從而破壞了腸道屏障結構,導致跨膜蛋白表達水平下降,腸道通透性增強,這與Jiang et al[34]的研究結果相似;與模型組相比,牛至香酚試驗組小鼠結腸組織Occludin、Claudin-1 mRNA的表達水平上調,且OccludinmRNA的表達水平與牛至香酚含量相關,這與“甘草酸劑量依賴性抑制Occludin表達”的結果[35]相一致;與模型組相比,牛至香酚高劑量組小鼠回腸和結腸組織Occludin、Claudin-1 mRNA的表達水平極顯著上調,這與“百里香酚與迷迭香酸組合能增強LPS攻毒大鼠腸道組織Claudin-1、OccludinmRNA的表達水平”的結果[20]相似,表明牛至香酚能通過增強LPS免疫應激小鼠腸道組織ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA的表達水平來維持腸道上皮細胞屏障功能的完整性。但牛至香酚的有效成分是如何影響緊密連接蛋白的結構和功能還需進一步研究。

本研究結果表明,牛至香酚通過調節LPS免疫應激小鼠血清細胞因子含量和腸道細胞因子、緊密連接蛋白mRNA的表達水平,修復腸道黏膜屏障結構,緩解LPS對腸道組織造成的免疫應激損傷。