柯樂豬異常乳腺組織的TMT蛋白組學分析

王春源, 熊 力, 楊紅文, 郭小江, 張依裕, 譚元成, 楊 酸

(1.貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省農業農村廳,貴州 貴陽 550001)

乳腺是哺乳動物的一個特殊器官,它能提供含有豐富營養和免疫物質的乳汁。初產母豬的乳腺發育,尤其是妊娠期的乳腺發育,對其畢生的泌乳性能具有決定性作用[1],且母畜乳腺的良好發育和泌乳功能的正常運行對于提升其生產力、仔畜存活率和降低疫(疾)病發生率具有重要意義[2]?？聵坟i是原產于貴州省西部烏蒙喀斯特高寒山區,經長期選育而成的一個地方豬品種,具有早熟、肉質優良、抗逆性強、母性好、抗病能力強和宜放牧等特點[3-4]。向程舉等[5]研究表明,柯樂豬繁殖力較低,其乳頭數多為5～6對,很少達到8對,窩總產仔數為8.20～8.45頭,窩產活仔數為7.67～7.96頭,窩斷奶仔數為6.98～7.33頭。據此,針對繁殖力較弱的柯樂豬品種,若能發掘母豬泌乳相關機制來調節乳腺發育,改善母豬泌乳能力,提高仔豬的成活率和初生重等指標,將會對該品種的整體養殖效益帶來顯著的影響。

近年來,關于柯樂豬的改良研究主要集中在肉質[6-7]、養殖模式[8]和耐粗飼特性[9]等方面,對繁殖方面的研究較少。而與乳腺發育機制的相關研究主要集中在多組學方面,部分研究者探討了外源性硫化氫[10]、月桂酸[11]和硬脂酸[12]等對青春期小鼠乳腺發育的影響,并進一步研究PI3K/Akt信號通路對母豬乳腺上皮細胞的調控機制[13]。楊強等[14]證實了JAK2/STAT5信號通路在豬妊娠75、90 d時被顯著激活的情況,這與乳腺的良好發育及泌乳功能有關。在飼糧中添加1α,25(OH)2VD3可以調節母豬乳腺發育、泌乳的潛在信號通路和差異表達蛋白的表達水平,并通過了蛋白組學驗證[15]。謝健等[16]通過全基因組關聯分析策略挖掘出關聯單核苷酸多態性(SNP)位點及候選基因,篩選出Wnt和Fgf信號通路中的候選基因:含有E3泛素蛋白連接酶的β-轉導蛋白重復序列(BTRC)、成纖維細胞生長因子5(FGF5)、成纖維細胞生長因子8(FGF8)、骨形態發生蛋白3(BMP3)、RASGEF域家族成員1B(RASGEF1B)、高機動性組框3(HMGB3),這些基因可能影響豬的乳頭數和繁殖性狀。哺乳動物的乳腺發育受遺傳、營養、內分泌和環境等多種因素的影響,從分子遺傳的角度發掘哺乳動物乳腺發育的關鍵調控基因或分子網絡信號通路,闡明其機制是改善乳腺發育的根本途徑。本研究利用串聯質譜標記(tandem mass tags, TMT)定量蛋白組學技術探究正常和異常乳腺組織中蛋白的表達水平,篩選與母豬乳腺發育相關的差異關鍵蛋白,旨在為柯樂豬在繁殖性能方面的選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 乳腺組織樣品來源

所選用的斷奶14 d后的柯樂豬經產母豬,來自貴州省畢節市赫章縣柯樂豬保種場。將乳腺發育正常(乳頭間距均衡、大小適中、發育正常)和異常(乳頭偏小凹陷、發育不良)的母豬各3頭交替屠宰,從每頭母豬采集3個乳腺組織樣品。取1 cm3左右的乳腺組織樣品迅速放入液氮中并帶回實驗室存放于冰箱(-80 ℃)中。乳腺組織樣品送至杭州景杰生物科技有限公司進行TMT定量蛋白組學技術分析。

1.2 蛋白提取

參考Chai et al[17]的方法,從冰箱(-80 ℃)中取出乳腺組織樣品,稱取適量樣品至研缽中,加入液氮研磨至粉末狀。在各粉末狀樣品中分別加入4倍體積的裂解緩沖液(含8 mol·L-1尿素、1%蛋白酶抑制劑)進行超聲裂解。于4 ℃、12 000×g離心10 min,除去細胞碎片,收集上清于新的離心管中,采用雙香草酸(BCA)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度。

1.3 蛋白酶解

參考文獻[18]的方法,在各組樣品中分別取100 μg蛋白進行酶解,加入適量的標準蛋白,用裂解液將體積調整至一致。加入1倍體積的預冷丙酮,渦旋混勻后再加入4倍體積的預冷丙酮,于-20 ℃下沉淀2 h。于4 500×g離心5 min,棄上清,用預冷的丙酮洗滌沉淀2次。沉淀晾干后加入終濃度為200 mmol·L-1的四乙基溴化銨,超聲打散沉淀,加入胰蛋白酶(蛋白酶與蛋白的質量比為1∶50)酶解過夜。加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol·L-1,于56 ℃還原30 min。加入碘乙酰胺使其終濃度為11 mmol·L-1,室溫下避光孵育15 min。

1.4 TMT標記和高效液相色譜分級

胰蛋白酶酶解的肽段采用Strata X C18反相色譜填料(Phenomenex公司)除鹽之后用真空冷凍干燥。用0.5 mol·L-1四乙基溴化銨溶解肽段,再按照TMT試劑盒說明書的步驟標記肽段[18]。本處理進行3次生物學重復,以發育正常的乳腺為對照。

1.5 液相色譜-質譜聯用分析

參考文獻[19]的方法,肽段采用液相色譜流動相A復溶,再使用EASY-nLC 1200超高效液相系統(上海斯邁歐分析儀器有限公司)進行分離。肽段經分離后被注入到NSI離子源中進行電離,之后進入Orbitrap ExplorisTM480質譜儀(賽默飛世爾科技公司)進行質譜分析。肽段母離子及其二級碎片均使用高分辨率的Orbitrap質譜儀(賽默飛世爾科技公司)進行檢測和分析,最后以數據依賴型掃描(DDA)程序的模式進行數據采集。

1.6 蛋白鑒定及定量分析

使用Maxquant(v1.5.2.8)和Proteome Discoverer(v2.4.1.15)軟件對質譜數據進行檢索,數據庫為Blast_Sus_scrofa_9823_PR_20220314.fasta(49 793條序列),定量方法設置為TMT-6plex,將蛋白、肽段和肽段譜匹配(PSM)共3個層面鑒定的假陽性率設置為1%,差異表達蛋白以差異倍數(FC)≥1.3或≤0.78,且P<0.05的條件進行篩選。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 差異表達蛋白注釋及亞細胞定位 利用Eggnog-mapper(v2.0)軟件將鑒定到的差異表達蛋白進行基因本體(gene ontology, GO)注釋分析和同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)功能分類;基于Pfam數據庫及相應的PfamScan工具對鑒定到的蛋白進行蛋白結構域注釋;基于京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路數據庫對蛋白通路進行注釋;鑒定到的蛋白經BLAST工具比對后選取比對得分最高的進行注釋;采用WolF Psort軟件對所提交的蛋白進行亞細胞定位預測和注釋。

1.7.2 差異表達蛋白功能富集分析 采用Pfam數據庫分析差異表達蛋白功能結構域的富集情況;采用KEGG數據庫分析差異表達蛋白的富集通路;使用費希爾精確檢驗(Fisher′s exact test)對鑒定到的差異表達蛋白進行結構域富集顯著性、GO富集顯著性和通路富集顯著性分析(以鑒定到的蛋白為背景),顯著水平設定為:P<0.05。

1.7.3 蛋白相互作用網絡分析 對篩選出的差異表達蛋白進行數據庫編號,利用STRING(v.11.0)蛋白互作網絡數據庫比對差異表達蛋白之間的互作關系,最后以R package中的軟件“networkD3”對差異表達蛋白互作網絡關系進行可視化展示。

2 結果與分析

2.1 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白的鑒定結果

正常和異常乳腺組織樣品共生成下機的二級譜圖381 256張,有效譜圖5 820張,有25 009條肽段被鑒定到,其中獨有的肽段序列有23 050個,共鑒定到4 961個蛋白,定量獲得4 882個蛋白。以差異倍數≥1.3或≤0.78,且P<0.05的條件進行篩選,最終篩選出474個差異表達蛋白,包括245個上調蛋白、229個下調蛋白。正常和異常乳腺組織差異表達蛋白的火山圖如圖1所示。

圖1 差異表達蛋白火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed proteins

圓圈顏色表示富集顯著性P值,圓圈大小表示功能或通路中的差異表達蛋白個數。

2.2 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白亞細胞定位預測結果

利用PSORTb(v3.0)軟件對正常和異常乳腺組織差異表達蛋白進行亞細胞結構注釋。結果(圖2)顯示,474個差異表達蛋白定位到8個條目上,分別為118個細胞外蛋白、115個細胞核蛋白、108個細胞質蛋白、49個線粒體蛋白、44個質膜蛋白、17個內質網蛋白、14個其他蛋白、9個同時存在于細胞質和細胞核上的蛋白。

2.3 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白的結構域

本研究共鑒定到137個蛋白結構域,排名前20位的結構域如圖3所示,主要富集在Sushi結構域(SCR重復)、絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域和免疫球蛋白V-集結構域上。

2.4 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白COG分類

數據庫比對結果(圖4)顯示,在信號轉導機制、細胞骨架、翻譯后修飾、蛋白轉換、伴侶蛋白、RNA的加工與修飾、真核細胞的細胞外結構和防御機制等功能中均存在差異表達蛋白。其中,出現頻次最多的是細胞過程和信號轉導類蛋白,出現頻次最少的是信息存儲和處理類蛋白,且有33個蛋白功能未確定。翻譯后修飾、蛋白轉換、伴侶蛋白及RNA的加工與修飾以上調蛋白為主;信號轉導機制、細胞骨架、真核細胞的細胞外結構和防御機制以下調蛋白為主;有少量上調蛋白的功能僅集中在復制、重組和修復以及次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝過程中。

圖4 差異表達蛋白COG分類Fig.4 COG classification of differentially expressed proteins

2.5 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白GO功能注釋和富集分析結果

將差異表達蛋白進行GO功能注釋分析。結果(圖5)顯示:生物過程主要注釋到351個細胞過程蛋白、284個生物調節蛋白、228個刺激反應蛋白;細胞組分主要注釋到372個細胞蛋白、348個細胞內蛋白、126個復合蛋白;分子功能主要注釋到280個結合功能蛋白、113個催化活性蛋白。

圖5 差異表達蛋白GO功能注釋分析Fig.5 GO enrichment annotation of differentially expressed protein

圖6顯示,GO富集到的差異表達蛋白有779個蛋白同時富集到生物學過程和細胞組分中,有321個蛋白富集到生物學過程中,有315個蛋白富集到細胞組分中,有143個蛋白富集到分子功能中。其中,差異表達蛋白主要富集到上皮細胞分化、皮膚形成和腎小管上皮細胞分化等生物學過程中;就細胞組分而言,差異表達蛋白主要分布在細胞外區域、細胞外空隙和角質化包膜中;在分子功能分類中,差異表達蛋白主要參與調節肽酶抑制劑活性、肽鏈內切酶活性和肽鏈內切酶抑制劑活性,其中,參與調節肽酶抑制劑活性的差異表達蛋白所占比例最高。

圖6 差異表達蛋白GO富集分析Fig.6 GO enrichment of differentially expressed protein

2.6 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白KEGG富集分析結果

KEGG是連接已知分子之間相互作用的信息網絡,富集最顯著的前10個分類的通路(圖7)顯示,差異表達蛋白在KEGG數據庫中注釋到189條KEGG信號通路,主要涉及補體系統信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)信號通路、金黃色葡萄球菌感染信號通路以及朊病毒病、全身性紅斑狼瘡、膽固醇代謝、雌激素、百日咳、癌細胞的轉錄失調、過氧化物等信號通路。

圖7 差異表達蛋白KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment of differentially expressed protein

2.7 正常和異常乳腺組織差異表達蛋白的互作關系

通過STRING(v.11.0)蛋白互作網絡數據庫對比得到差異表達蛋白的互作關系,將篩選的前50個互作關系最緊密的蛋白繪制出蛋白互作網絡圖(圖8)。圖8顯示:關聯度排名前10位的差異表達蛋白為A0A286ZT13(白蛋白)、P06867(血纖維蛋白溶酶原)、A0A5S8KLN1(叢生蛋白)、A0A287A481(血纖維蛋白溶酶原)、P50447(α-1-抗胰蛋白酶)、F1S0J8(角蛋白)、Q8SPS7(結合珠蛋白)、A0A286ZMB2(葉酸γ-谷氨酰水解酶)、F1SCC9(含絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域的蛋白)、F1S715(α-L-巖藻糖苷酶);關聯度最高的蛋白為A0A286ZT13(白蛋白),可調節多個信號通路。其中,有3個差異表達蛋白與補體系統有關,分別為A0A5S8KLN1(叢生蛋白)、P50447(α-1-抗胰蛋白酶)、P06867(血纖維蛋白溶酶原);有1個上調的差異表達蛋白F1S0J8(角蛋白)與雌激素信號通路相關;有3個上調的差異表達蛋白與動物器官發育有關,分別為A0A5S8KLN1(叢生蛋白)、A0A287A481(血纖維蛋白溶酶原)、F1S0J8(角蛋白);有2個下調的差異表達蛋白均富集在絲氨酸型內肽酶抑制劑活性、肽酶抑制劑活性和蛋白水解酶活性調控的分子功能上,分別為P50447(α-1-抗胰蛋白酶)、F1SCC9(含絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域的蛋白);P06867(血纖維蛋白溶酶原)在絲氨酸型蛋白水解酶活性、絲氨酸水解酶活性、絲氨酸型內肽酶活性的分子功能上均有富集;A0A287A481(血纖維蛋白溶酶原)、F1S0J8(角蛋白)、P06867(血纖維蛋白溶酶原)在金黃色葡萄球菌感染信號通路中均有富集表現。

圓圈表示差異表達蛋白;不同顏色表示蛋白的差異表達情況(綠色為下調蛋白,紅色為上調蛋白);顏色越深,表示差異倍數越大。

3 討論

母豬發育良好的乳腺是仔豬正常生長發育的基礎,足夠且營養的乳汁對于仔豬的成活率和生長發育起決定性作用[20]。本研究利用TMT定量蛋白組學技術在柯樂豬乳腺組織中篩選出與乳腺發育相關的差異表達蛋白;功能與富集分析及蛋白網絡互作分析顯示,篩選出了部分較為顯著的差異表達蛋白,可為乳腺發育機制研究和選育工作提供參考。

本研究共鑒定到4 961個蛋白,定量獲得4 882個蛋白,篩選出474個差異表達蛋白,包括245個上調蛋白、229個下調蛋白;亞細胞定位在細胞外、細胞核和細胞質上的差異表達蛋白居多,這與細胞組分富集在細胞外區域和細胞外空隙的結果基本一致;主要富集在Sushi結構域(SCR重復)和絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域的差異表達蛋白較多。Sushi結構域是進化保守的蛋白結構域,是補體控制蛋白分子,在調節補體激活的蛋白中普遍存在,又被認為是補體控制蛋白結構域的基本組成部分,該結構域包含的蛋白通常參與營養結合和信號傳導[21-22]。在蛋白互作關聯度最高的10個差異表達蛋白中,就有3個富集在補體系統信號通路中,這與主要富集在補體系統的KEGG富集結果相契合,表明該通路在母豬乳腺的發育中起著重要的調控作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類分布廣泛的蛋白酶抑制劑超家族,對動物生理反應起調節作用[23]。在蛋白互作網絡圖中,較為核心的差異表達蛋白為P50447(α-1-抗胰蛋白酶)和F1SCC9(含絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域的蛋白),這2個下調蛋白均富集在絲氨酸型內肽酶抑制劑活性的分子功能上,P06867(血纖維蛋白溶酶原)在絲氨酸型蛋白水解酶活性、絲氨酸水解酶活性、絲氨酸型內肽酶活性的分子功能上均有富集表現,表明絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域蛋白是參與乳腺發育的相關蛋白。

篩選到的差異表達蛋白通過功能與富集分析顯示,其生物過程主要注釋在細胞過程、生物調節和刺激反應上;細胞組分主要為細胞蛋白、細胞內蛋白和含蛋白的復合物;分子功能主要注釋在結合功能和催化活性上。此結果與Jaswal et al[24]對水牛乳腺上皮細胞中超過12 500個蛋白的分析結果一致。KEGG通路主要涉及補體系統信號通路、PPAR信號通路、金黃色葡萄球菌感染信號通路。如:Palombo et al[25]利用RNA測序分析母豬乳腺組織從初乳向常乳轉變過程中的轉錄譜,表明PPAR信號通路中的基因大量上調;Paten et al[26]和Chen et al[27]利用轉錄組學手段的研究表明,PPAR信號通路在成年綿羊和湖羊的乳腺功能發育中起著關鍵作用。本研究結合差異倍數和P值篩選出10個核心差異表達蛋白[上調蛋白有P14287(骨橋蛋白)、F1RXF9(角蛋白25)、I3LDS3(角蛋白10)、Q75QW1(上皮細胞黏附分子)、A0A5S8KLN1(叢生蛋白)、F1RW75(橋粒素),下調蛋白有A0A286ZT13(白蛋白)、P06867(血纖維蛋白溶酶原)、F1SCC9(含絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域的蛋白)、P50447(α-1-抗胰蛋白酶)];相對于正常和異常乳腺組織的主要互作蛋白,F1RXF9(角蛋白25)、I3LDS3(角蛋白10)、A0A287A481(血纖維蛋白溶酶原)、F1S0J8(含IF桿狀結構域的蛋白)、P06867(血纖維蛋白溶酶原)在金黃色葡萄球菌感染信號通路中均有富集表現。研究表明:哺乳動物乳腺炎是由一系列微生物感染乳腺組織引起的,其中就有金黃色葡萄球菌,受到該菌攻擊的牛乳腺上皮組織中的轉錄反應特征不明顯,尤其是在感染的最早期[28];同時,金黃色葡萄球菌能產生許多細胞外毒素,這些毒素與被感染細胞的凋亡存在著密切的關系,且產PV-殺白細胞素(PVL)在金黃色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮細胞的過程中起重要作用[29]。乳腺是哺乳動物特有的器官,其合成乳汁的能力在很大程度上取決于功能性乳腺上皮細胞的數量和效率[30]。本研究篩選得到的6個較為核心的上調蛋白均與動物器官發育相關,且大部分上調蛋白主要富集到上皮細胞分化、皮膚形成和腎小管上皮細胞分化等生物學過程中,可能直接或間接通過影響乳腺上皮細胞分化從而影響乳腺發育過程。本研究利用TMT蛋白組學技術篩選柯樂豬正常和異常乳腺組織中的差異表達蛋白,共篩選到474個差異表達蛋白,通過功能與富集分析及蛋白互作網絡分析,篩選出的10個核心差異表達蛋白主要富集在補體系統信號通路、PPAR信號通路、金黃色葡萄球菌感染信號通路中,主要涉及動物器官發育、上皮細胞分化、肽酶抑制劑活性調節等功能,可作為后期驗證的待定蛋白,為進一步研究柯樂豬乳腺發育調控機制提供參考。