大黃素聯合5AzA-cdR增強對胰腺癌細胞ppENK抑癌基因的去甲基化作用研究

陳亮 唐堅 褚永權 葉劍宏 沈超 錢曉宇 姚旭楓

胰腺癌其臨床表現隱匿，早期診斷困難，容易發生遠處轉移，是預后很差的消化系統惡性腫瘤之一，總體五年生存率為10%左右[1]。盡管手術切除是唯一可能的治愈手段，但由于胰腺癌早期癥狀不典型、易發生轉移等特點，大部分患者就診時已無法根治性切除[2,3]?；虻漠惓＜谆悄[瘤發病的重要原因之一，抑癌基因的高甲基化會導致轉錄抑制甚至丟失，從而導致異常分化、增殖、癌變[4]。5-氮-2′脫氧胞苷（5-AzA-2′-deoxycytidine，5AzA-cdR）是目前最常用的去甲基化核苷類似物之一[7]。本次研究旨在研究大黃素聯合5AzA-cdR用藥對胰腺癌抑癌基因ppENK的去甲基化作用?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 研究時間為2022 年1 月至2022年12 月，本次研究在嘉興市第一醫院中心實驗室完成，人胰腺癌細胞株Panc1 由本次研究組引進并保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞系和培養 將人胰腺癌細胞株Panc1置于胎牛血清中，在100 U/mL鏈霉素和青霉素DMEM培養基，37 ℃、飽和濕度、5% CO2下培養，2～4 d換液一次，待細胞生長至70%～80%時傳代培養，取其對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞計數實驗（cell counting kit-8，CCK-8）取對數生長期的Panc1 細胞于96 孔板中，每孔接種5×103/100 μL 細胞，分別使用濃度為0、10、20、40、80 μmol/L 的大黃素處理細胞24 h、48 h 和72 h，每組同時設6 個副孔。細胞培養結束后，每孔加入10 μL 的CCK-8 繼續培養1～2 h，用酶標儀測定各孔在450 nm 波長下的光密度（optical density，OD），實驗重復3 次。并計算細胞抑制率，從而選出最適大黃素濃度。

細胞抑制率=（1-實驗組OD 值/對照組OD值）×100%

1.2.3 實驗分組 將培養后的Panc1 細胞分為四組接受不同的處理：對照組、最適大黃素濃度組（40 μmol/L）、5AzA-cdR 組（1 μmol/L）和大黃素（40 μmol/L）聯合5AzA-cdR（1 μmol/L）用藥組。

1.2.4 Dot-blot 實驗 四組作用于Panc1 細胞72 h后，用細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（由上海杰瑞生物工程有限公司生產）按照說明提取各組DNA，使用HS dsDNA Kit 和Qubit Fluormeter（Invitrogen）通過熒光測定術來測定DNA 的濃度。四組DNA 打在尼龍膜上（Hybond-N+，GE），置于紫外發光儀器中5 min，隨后5%脫脂牛奶封閉1.5 h，洗滌5 min，3 次，一抗（anti-5mc）4 ℃孵育過夜，一抗孵育結束后二抗室溫孵育1 h，洗滌后ECL發光上機檢測，打點的灰度值通過Image-J軟件分析。

1.2.5 亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）使用細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，按照說明書提取四組DNA，取1 μg DNA進行亞硫酸鹽修飾，反應體系結束后，取10 μL PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳45 min，電泳結束后拍UV照片，檢查BSP 反應產物，反應產物回收，送上海麥普生物技術有限公司進行克隆，隨機選取10 個克隆進行測序，使用BiQ Analyzer 軟件分析樣本的甲基化狀態。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用F檢驗和LSD-t檢驗。設P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同大黃素濃度對Panc1細胞生長抑制作用見表1

表1 不同大黃素濃度對Panc1細胞的生長抑制率比較

由表1 可見，大黃素以時間梯度和濃度梯度抑制胰腺癌細胞Panc1生長，40 μ mol/L濃度作用72 h后細胞生長抑制率接近半數抑制率。

2.2 四組5 mc水平和ppENK甲基化率比較見表2

表2 四組5 mc水平和ppENK甲基化率比較

由表2可見，四組的5 mc水平和ppENK甲基化率比較，差異均有統計學意義（F分別=69.86、785.14，P均＜0.05）。Dot-blot 實驗顯示，最適大黃素濃度組和5AzA-cdR 組5 mc 水平低于對照組，差異均有統計學意義（t分別=12.55、20.12，P均＜0.05），5AzA-cdR 組相對5 mc 水平較最適大黃素濃度組下降明顯，差異有統計學意義（t=17.76，P＜0.05），大黃素聯合5AzA-cdR 用藥組5 mc的水平較對照組、最適大黃素濃度組以及5AzA-cdR 組明顯下降，差異有統計學意義（t分別=30.22、20.77、10.45，P均＜0.05）。BSP 結果顯示，最適大黃素濃度組和5AzA-cdR 組ppENK 甲基化率均低于對照組，差異均有統計學意義（t分別=14.27、21.34，P均＜0.05），5AzA-cdR 組ppENK 甲基化率較最適大黃素濃度組下降明顯，差異有統計學意義（t=16.41，P＜0.05），大黃素聯合5AzA-cdR 用藥組ppENK 甲基化率較對照組、最適大黃素濃度組以及5AzA-cdR組明顯下降，差異均有統計學意義（t分別=32.68、19.33、10.12，P均＜0.05）。

3 討論

近年來，胰腺癌的發病率逐年上升。大多數患者確診時已經發生轉移，失去了根治性手術機會，預后很差。雖然近年來臨床使用吉西他濱已將晚期胰腺癌患者的1 年生存率提高約20%，但并未取得明顯改善。越來越多的證據表明，許多腫瘤它從表觀遺傳變化和基因突變開始，并啟動腫瘤促進過程。表觀遺傳變化是基因表型的變化，它是不改變基因的DNA 序列的變化。DNA 甲基化是基因表觀遺傳修飾的重要手段之一，DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化，以S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供體的形式催化，其不改變DNA序列和遺傳密碼，將甲基轉移到特定的堿基上，并且是可逆的。

Ueki等[5]報告ppENK基因含有42 個CpG島，其中有7 個CpG 島在胰腺癌細胞系中的甲基化率為93%，而在正常胰腺組織中則沒有甲基化，表明ppENK以及轉錄抑制是胰腺癌發生中的常見事件。Fukushima等[6]報道了15 例浸潤性導管腺癌中14 例的ppENK 甲基化，但非腫瘤胰腺上皮沒有甲基化。目前最常用的去甲基化藥物主要有阿扎胞苷和地西他濱兩種核苷類似物[7]，5AzA-cdR 是目前應用最廣泛的去甲基化核苷類似物之一，主要通過在低濃度下抑制DNMT 的表達和活性發揮去甲基化作用，但其毒副作用較大，最明顯的是藥物毒性和骨髓抑制，限制了其在腫瘤方面的臨床應用。因此，開發具有去甲基化作用、毒副作用小的藥物具有重大意義。

根據課題組前期研究，已知大黃素對胰腺癌細胞Panc1 具有一定程度的去甲基化作用，但大黃素的去甲基化強度較5AzA-cdR弱。目前治療腫瘤多為聯合用藥，基于此本課題組提出大膽設想，大黃素聯合5AzA-cdR作用于胰腺癌細胞時會不會比兩種藥物單獨作用更強？本次研究根據CCK-8 實驗結果選擇了大黃素濃度為40 μmol/L 進行進一步實驗。Dot-blot 結果表明，40 μmol/L 大黃素組和5AzA-cdR 組與對照組比較可以降低基因組相對5 mc 的表達，40 μmol/L 大黃素組的作用強度要弱于5AzA-cdR 組，特別當40 μmol/L 大黃素與5AzAcdR聯合使用時，5mc的水平顯著降低，這充分說明40 μmol/L 大黃素可以增加5AzA-cdR 對胰腺癌細胞的去甲基化作用。為了進一步驗證去甲基化作用，本次研究BSP 結果顯示對照組、大黃素組、5AzA-cdR 組、大黃素聯合5AzA-cdR 用藥組處理Panc1 細胞72 h 后，ppENK 基因的甲基化率逐漸下降，可見大黃素聯合5AzA-cdR 用藥可以明顯增加其對抑癌基因ppENK 的去甲基化作用。在生物體內，催化甲基化反應的主要是甲基轉移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b），使抑癌基因發生去甲基化的途徑主要有抑制甲基轉移酶的活性和減少甲基轉移酶的表達兩種方式，其是否可以抑制甲基轉移酶的活性和表達，還有待于后期研究。

綜上所述，40 μmol/L 大黃素聯合5AzA-cdR 藥物可以降低5 mc 的基因組水平，可以對Panc1 抑癌基因ppENK發揮明顯的去甲基化作用，且作用強度要比兩藥的單一用藥強，這一發現為胰腺癌的臨床治療機制提供了新思路，而表觀遺傳學中的聯合用藥去甲基化作用也是其發揮作用的重要機制。