鎖陽中19種無機元素的NIR快速測定模型的建立與適宜測定元素篩選

顧志榮，祁 梅，楊 浩，郭 燕，葛 斌*

（1.甘肅省人民醫院 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000）

鎖陽是重要的中藥及蒙藥，也是功能保健食品原料，來源于鎖陽科（Cynomoriaceae）植物鎖陽（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉質莖［1］。鎖陽是一種沙漠寄生植物，多寄生于蒺藜科白刺屬植物根部，主要產于內蒙古、甘肅、新疆以及青海等西北沙漠地帶［2］。鎖陽含有豐富的治療性及保健性成分（包括黃酮類、多糖類、多酚類、三萜類、氨基酸以及礦質元素［3-6］等），具有調節性激素水平［7］、促進生殖功能［8］、降血糖［9］、抗氧化損傷［10］以及抗腫瘤［11］等功效。鎖陽同時含有豐富的礦質元素及重金屬、有害元素，對人體補充礦質元素具有很大的益處，但同時存在著引起重金屬及有害元素蓄積中毒的可能。

本研究組前期建立了鎖陽中19 種無機元素的電感耦合等離子體-質譜（Inductively coupled plasma - mass spectrometry，ICP - MS）測定方法［12］，并對Pb、Cd、Cr、As、Hg、Cu 等重金屬及有害元素的超標情況進行了研究，發現個別產地的樣品存在超標情況；同時分析了鎖陽中重金屬及有害元素的污染情況，并評估健康風險，結果提示鎖陽中As、Pb、Cr及重金屬總含量存在一定風險，對人體有一定的非致癌作用［13］。

近紅外光譜（Near-infrared spectroscopy，NIR）定量測定技術是近年來新興的快速、綠色測定技術，已廣泛用于農業［14］、工業［15］、食品［16］以及制藥［17］等各領域，具有檢測速度快、檢測效率高、樣品前處理簡單、可同時測定多成分等優點。該法傳統僅應用于有機成分測定，無機元素較少涉及，這是因為NIR 的主要信息來源是有機物的C - H、O - H、N -H、S - H 等分子振動，而無機元素在近紅外區沒有吸收，因此無法直接測定。但藥用植物中的無機元素不是以單一離子形態存在，而是與蛋白質、氨基酸、淀粉、有機酸等結合形成絡合物或螯合物，進而能夠間接地在近紅外區產生吸收峰，或無機元素含量與樣品中某些有機組分含量之間存在相關關系，因此利用這種絡合關系或含量相關關系，可間接采用NIR 技術快速測定無機元素含量［18-19］。目前，采用NIR 技術快速測定中藥中無機元素含量未見相關報道，在農業領域已用于快速測定棉籽［18］以及稻米［14］等的無機元素含量。

本研究首次嘗試建立鎖陽中19 種無機元素含量的NIR 快速測定模型，篩選適宜采用NIR 技術進行測定的元素，為鎖陽無機元素測定提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

82批鎖陽樣品分別采集于甘肅（32批）、內蒙古（17 批）、新疆（12 批）、青海（12 批）、寧夏（9 批）等5個?。▍^），所有樣品均經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為鎖陽（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉質莖。將樣品自然陰干，粉碎后過80 目篩，冷藏備用。Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Co、Sr、Ni、Ag、Ba、Ti、Pb、Cr、Cd、As、Hg、Cu 單元素標準溶液濃度為1 000 μg/mL，購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；Ge、In、Bi、Sc 單元素內標液濃度為10 μg/mL，購自SPEX CertiPrep 公司；柑橘葉成分分析標準物質（批號GBW10020）購自中國地球物理化學勘察研究所；HNO3、H2O2為優級純，水為去離子水。

1.2 主要儀器

Nicolet - 6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；iCAP RQ 型電感耦合等離子體質譜（ICP - MS）儀（美國Thermo Fisher 公司）；ETHOS 900微波消解系統（意大利Milestone公司）；Milli - Q 超純水裝置（法國Millipore 公司），電阻率≥ 18.2 M?/cm；Sartorius BT 125D 萬分之一電子天平（德國Sartorius 集團）；DZF - 6090 型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。無機元素測定所用玻璃儀器均以濃硫酸浸泡過夜，再以去離子水徹底沖洗備用。

1.3 NIR光譜采集

開啟NIR 儀，預熱半小時，采用積分球漫反射方式采集原始光譜。將樣品粉末于60℃干燥至恒重，混勻，置于旋轉杯內壓實，以內置背景為參比，掃描范圍10 000 ~ 4 000 cm-1，掃描64 次，分辨率8 cm-1，溫度（25 ± 0.5）℃，相對濕度20% ~ 30%，每批樣品重復采集3次，取平均光譜。

1.4 ICP - MS測定19種無機元素化學參考值

ICP - MS 工作條件［12］為：等離子體射頻功率1 300 W；霧化氣（氬氣）流量、輔助氣流量、等離子流分別為1.1、1.0、15.0 L/min；霧化室為石英雙通道，溫度2℃；采樣錐孔徑、截取錐孔徑、采樣深度分別為1.1、0.4、7.0 mm；脈沖電壓1 050 V；蠕動泵轉數40 r/min；炬管為石英一體化，2.5 mm 中心通道；駐留時間30 ms；動能歧視（Kinetic energy discrimination，KED）電壓3 V。Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Sr、Ni、Ti、As 采用Ge 作為內標，Ag、Ba、Pb、Hg、Cd 采用In 作為內標。重復測定3 次，取平均值。方法學考察表明，本方法滿足實驗要求。

1.5 建模光譜波段的選擇

采用TQ Analyst 8.0 定量分析軟件的自動優化功能篩選最佳建模光譜波段。

1.6 光譜預處理方法的選擇

以決定系數R2、校正均方差（RMSEC）、預測均方差（RMSEP）和留一法交叉驗證均方差（RMSECV）為衡量指標，考察未處理光譜（None）、標準正態變量校正（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階導數（FD）、二階導數（SD）和移動窗口最小二乘多項式平滑（SG）等常見光譜預處理方法及組合方法，篩選最佳光譜預處理方法。

1.7 因子數的選擇

以RMSECV及決定系數R2為考察指標，以內部交互驗證法篩選19種無機元素的最佳模型因子數。

2 結果與分析

2.1 NIR光譜

82批鎖陽樣品的NIR疊加見圖1。

圖1 鎖陽近紅外光譜圖Fig.1 NIR spectra of Cynomorii Herba

2.2 樣品集劃分與化學參考值分布

Dixon檢驗表明82批樣品均無異常光譜。隨機抽取57批（占樣品總數的70%）作為校正集，其余25批（占樣品總數的30%）作為驗證集。各元素在樣品集中的含量分布見表1?？梢钥闯?，各元素含量在樣品集中的分布范圍較廣，代表性良好，滿足模型建立要求。

表1 樣品集劃分及化學參考值分布Tab. 1 Results of sample set partitioning and chemical reference distribution

2.3 偏最小二乘法（PLS）定量模型的建立與評價

優化得到鎖陽中19 種無機元素的最佳建模光譜波段、光譜預處理方法及因子數（見表2）。校正模型的相關性見圖2，模型結果見表3?？芍?，K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr 元素的決定系數R2及交叉驗證R2均大于0.9，RMSEC、RMSEP 及RMSECV在0.52 ~ 2.20 之間，所建模型的預測值與參考方法測得的真實值之間具有較好的相關性，模型預測性能較好，適宜采用NIR 技術進行快速測定。Ni、Zn元素的決定系數R2及交叉驗證R2在0.8 ~ 0.9 之間，RMSEC、RMSEP及RMSECV在0.49 ~ 1.41之間，預測值與真實值之間的相關性一般。而Cu 元素的決定系數R2及交叉驗證R2在0.7 ~ 0.8 之間，Na、Fe、Ag、Ba、Pb、Cd、As、Hg 元素的決定系數R2及交叉驗證R2均小于0.7，此9 種元素的RMSEC、RMSEP 及RMSECV 在1.13 ~ 10.75 之間，預測值與真實值之間的相關性較差，不適宜采用NIR 技術進行快速測定。

2.4 模型的外部驗證

選擇未參加建模的10批樣品輸入模型，對適宜采用NIR 技術進行快速測定的K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr 等8 種元素的校正模型進行外部驗證，以驗證集中樣品的模型預測值與ICP - MS實測值的比值作為預測回收率，得8種元素的模型預測值和真實值之間的相對誤差在0.04% ~ 7.62%之間，平均預測回收率在94.12% ~ 108.45%之間，表明模型預測值與實測值基本相符，百分偏差較小，預測結果較為準確。以各元素的模型預測值與實測值進行配對t檢驗，結果均為P> 0.05（α= 0.05），預測值與真實值無顯著性差異，表明2種檢測方法不存在系統誤差。因此，利用NIR 技術快速測定鎖陽中K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti以及Cr等8種元素的含量是可行的。

3 討論與結論

3.1 與同類研究比較

礦質元素是鎖陽的重要營養物質，目前相關研究較多。采用原子吸收光譜（Atomic absorption spectroscopy，AAS）對鎖陽無機元素進行測定的元素種類包括Na、K、Mg、Ca、Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Pb、Cr、Cd、Au 以及Ag 等15 種，但不包括本研究中的Sr、Ba、Ti、As以及Hg元素，主要原因是AAS對痕量元素靈敏度及檢測限達不到要求而無法同時測定［20］。而ICP - MS 準確度及靈敏性更高，可檢測到的鎖陽無機元素更多［12］，但存在長時間的樣品預處理過程消耗大量HNO3、HF 等腐蝕性強酸，污染環境，危險系數高，對實驗操作技術及實驗儀器設備質量要求高，儀器設備及檢測費用昂貴，操作繁瑣，不利于大規模樣品測定等諸多不足。NIR快速測定無機元素技術可以解決上述不足，但用于鎖陽的無機元素測定尚屬空白。

3.2 NIR適宜測定的元素分析

由表3 可知，不是每一種鎖陽中的無機元素含量都適宜采用NIR 技術進行快速測定。K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr 等8 種元素的相關性與模型預測性能均較好，適宜采用NIR 技術進行快速測定。而Ni、Zn 元素的決定系數R2及交叉驗證R2在0.8 ~ 0.9之間，相關性一般，因此需要進一步增大樣本量，對模型進行優化，以提高預測精度。Cu元素的決定系數R2及交叉驗證R2在0.7 ~ 0.8 之間，而Na、Fe、Ag、Ba、Pb、Cd、As、Hg元素的決定系數R2及交叉驗證R2均小于0.7，此9 種元素的預測值與真實值之間相關性較差，不適宜采用NIR 技術進行快速測定，可能是因為這些元素沒有很好地與有機物相絡合，因此光譜信息不能被間接采集。

3.3 “共線性”現象分析

Hg 元素實測值與PLS 模型預測值存在“共線性”現象，這是因為在鎖陽中Hg 含量極低，樣品集濃度跨幅較小，濃度集中在較小范圍，加之化學參考值有效數字保留問題，導致許多樣品的化學參考值相同而在相關圖顯示“共線性”，因此Hg 不宜使用NIR快速測定。

3.4 研究結論與局限性

采用NIR 技術快速測定無機元素含量，與被檢測對象的化學成分密切相關，因此對于不同藥物、不同元素不可一概而論。本研究表明，利用NIR 技術快速測定鎖陽中K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti以及Cr等8 種元素的含量是可行的，對其他元素則檢測準確度不足?？傮w來講，因為是利用中藥中無機元素離子與有機成分的絡合關系或含量相關關系進行間接檢測，因此即使對于適宜采用NIR 技術進行快速測定的元素，其決定系數R2及交叉驗證R2也未完全達到100%，RMSEC、RMSEP 及RMSECV 總體偏大，與檢測有機成分相比，模型相關性及預測能力并不完美，但誤差仍在可接受范圍內。