膝關節骨性關節炎并內翻畸形股骨髁軟骨退行性變觀察研究

陳德勝， 王胤斌， 張晉寧， 楊天翔， 張博文， 郭鳳英， 李 燕

（1.寧夏回族自治區人民醫院骨科，寧夏醫科大學第三臨床學院，銀川 750002； 2.寧夏醫科大學，銀川 750004；3.寧夏醫科大學基礎醫學院，銀川 750004）

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨的變性、破壞及骨質增生為主的伴有關節疼痛、腫脹、畸形及活動障礙的慢性關節疾病，常見于負重關節[1-3]。膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）發病率為8.1%[4]。KOA 并內翻畸形是由于關節軟骨細胞代謝異常、軟骨基質被破壞。關節的軟骨結構中的鈣化層和軟骨下骨的改變在KOA 并內翻畸形發生、發展進程中發揮著重要作用[5-6]。本研究采用組織學及超微結構，觀察KOA 并內翻畸形的病理形態學，以期為KOA 并內翻畸形的骨軟骨結構改變的機制研究提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年11 月1 日至2021 年10 月31日就診于寧夏回族自治區人民醫院及寧夏醫科大學總醫院行人工全膝關節置換術的KOA 并內翻畸形的55 例患者。其中，男性24 例，女性31 例；平均年齡（71.32±6.22）歲。收集患者經人工全膝關節置換術截骨去除的股骨內外髁的骨及關節軟骨組織，用4%多聚甲醛固定為標本。將55 例患者的股骨內髁設為觀察組，股骨外髁設為對照組。標本的收集均獲得患者及家屬的知情同意，獲得寧夏醫科大學總醫院（批準號：2020-974）和寧夏回族自治區人民醫院［批準號：〔2022〕-LL-018］醫學倫理道德委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：1）參照《中國骨關節炎診療指南（2021 年版）》[7]診斷為膝骨性關節炎的患者；2）年齡50～80 歲，體質量指數（body mass index，BMI）18.0～31.5 kg·m-2；3）單側人工膝關節置換術均為患者初次手術；4）術前下肢血管超聲無深靜脈血栓；5）手術實施及病例隨訪均由同組醫師完成。

排除標準：1）患有冠心病、腦血管疾病等手術禁忌證者；2）患有糖尿病、類風濕性關節炎者；3）近期有關節藥物注射史、止痛藥物服用史，有糖皮質激素治療史，患有免疫性疾病者。

1.3 方法

1.3.1 手術方法 手術均由同組醫師完成。麻醉滿意后，采取膝前正中切口，繞髕骨內側進入關節內入路；股骨側髓內定位，定位桿入髓點在植入假體前用骨栓封閉，脛骨側髓外定位，植入膝關節表面置換假體，股骨與脛骨假體均采用骨水泥固定，髕骨關節面予以修整和去神經化，術中關節腔及切口周圍“雞尾酒”麻藥局部注射，放置切口引流。用紗布棉墊包扎。

1.3.2 大體形態觀察 行人工全膝關節置換術中外翻髕骨，顯露后觀察股骨內外髁與軟骨大體形態變化。采用截骨術去除骨與軟骨組織，采用相應的固定液固定，進行形態學觀察。

1.3.3 蘇木素-伊紅（HE）染色 將切片置于37 ℃恒溫箱中過夜，分別經過二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ和95%、90%、80%、70%乙醇各5 min，水洗，入蘇木素染液染色10 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化3 s 后自來水沖洗，反藍20 min，伊紅染色1 min，分別置于95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明，風干后用中性樹脂封固，于顯微鏡下觀察。

1.3.4 番紅O-固綠染色 將組織切片于37 ℃烤箱中過夜，分別經過二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、不同濃度乙醇各5 min 脫蠟，加入新鮮配制的Weigert 染液3～5 min，1%氯化氫乙醇分化20 s，固綠染液內浸染5 min，番紅浸染2 min，乙酸溶液漂洗1 min，不同乙醇脫水，風干，二甲苯透明2 min，中性樹脂封固，于顯微鏡下觀察。

1.3.5 免疫組織化學染色 切片烤片、脫蠟、沖洗3 次；4 ℃的3% H2O2孵育30 min，消除內源性過氧化物酶，PBS 緩沖液沖洗3 次；然后將切片放入盛有PBS 緩沖液的收納盒中，置入煮沸的0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液煮15 min，再將收納盒放入0 ℃冰水混合物中降溫30 min，輔助抗原修復；PBS 緩沖液沖洗3 次后，滴加稀釋的羊血清封閉20 min，沖洗、擦干后，滴加一抗（兔抗人Osterix 單克隆抗體）孵育，4 ℃過夜。次日PBS 緩沖液沖洗擦干，滴加二抗（山羊抗兔IgG 聚合物）孵育，37 ℃孵育30 min，沖洗后DAB 顯色液顯色20 s，蘇木素復染5 min，蒸餾水沖洗2 次，1%氯化鈉乙醇分化20 s，沖洗、脫水、透明后，中性樹脂封固。免疫組化結果應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，觀察兩組軟骨細胞中Osterix 的平均光密度（OD）值，并進行對比。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察 棄去西林瓶中的液體，更換為4 ℃預冷的1%鋨酸浸泡，置于4 ℃冰箱保存，2 h 后用0.1 mol·L-1二甲砷酸沖洗3次，不同濃度乙醇4 ℃脫水，不同濃度乙醇室溫下脫水，脫水完成后分別經環氧丙烷、等比不完全包埋液和環氧丙烷混合液、2∶1 的不完全包埋液和環氧丙烷混合液滲透；完成滲透后再次加不完全包埋液室溫過夜。次日先置入完全包埋液浸泡后，分別經35 ℃、42 ℃、60 ℃溫箱溫育。最后以臨界干燥法抽真空2 周，將干燥樣品黏附在金屬樣品臺上，使用噴鍍儀真空噴鍍5～6 min，于電子顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

所有數據運用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體形態觀察

觀察組股骨髁關節面不光滑，色澤灰暗，部分軟骨剝脫有軟骨下骨外露，股骨髁軟骨面缺損明顯，呈潰瘍狀，股骨髁多處外緣可見骨贅形成，軟骨下骨可見松質骨硬化灶（圖1A）；對照組股骨髁軟骨面較光滑且平整，未見軟骨明顯缺失，軟骨表面色澤清亮、均勻，呈乳白色，股骨髁邊緣清晰，有少量骨贅生成（圖1B）。

圖1 股骨髁大體外觀照

2.2 HE 染色結果

光鏡下可見觀察組軟骨面凹凸不平，軟骨細胞排列不規整，潮線紊亂，軟骨下骨質部分異常增厚，可見血管翳從潮線通過，關節軟骨被侵蝕和破壞，潮線不完整，軟骨下骨出現彌漫性局灶增生現象，不同組織分層界線消失（圖2A）；對照組軟骨面較為光滑、平整，軟骨著色均勻，軟骨細胞數量多，基質豐富，無局灶性增生（圖2B）。

圖2 股骨髁HE 染色結果（×20）

2.3 番紅O-固綠染色結果

觀察組軟骨表面存在裂隙，軟骨層著色強度不均勻，番紅染色在成簇狀軟骨細胞周圍深染，磨損較重的軟骨表面有失染現象，軟骨基質及細胞數減少，成簇狀排列，軟骨層與軟骨下骨未見明顯邊界，軟骨下方穿插有綠染的骨組織（圖3A）；對照組軟骨面平整，軟骨區域著色均勻，無深染或失染現象，細胞核數量較觀察組多，排列分散、紊亂，軟骨基質豐富，于軟骨下骨可見明顯分界，軟骨無硬化或纖維化表現（圖3B）。

圖3 股骨髁番紅O-固綠染色結果（×20）

2.4 免疫組織化學染色結果

Osterix 蛋白在胞核中表達，呈棕褐色。觀察組軟骨細胞中的Osterix 陽性表達少于對照組（圖4）。觀察組Osterix 蛋白OD 值低于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 Osterix 免疫組織化學染色結果（±s）

表1 Osterix 免疫組織化學染色結果（±s）

組別Osterix 蛋白OD 值觀察組1.156±0.588對照組4.035±1.076 t 值10.161 P 值＜0.001

圖4 股骨髁Osterix 免疫組織化學染色結果（×20）

2.5 掃描電鏡結果

在10 000 倍掃描電子顯微鏡下可觀察到，觀察組軟骨毀損嚴重、結構不清，軟骨面凹凸不平，存在大量增生凸起及空洞裂隙；對照組表面較為光潔，可見大量軟骨細胞凸起及皺褶，軟骨間質均勻，見圖5。

圖5 掃描電子顯微鏡結果（×5 000）

3 討論

KOA 是老年人常見的退行性關節疾病。KOA的主要臨床表現為膝關節疼痛、腫脹、活動受限，隨著年齡的增長以及長期的高運動負荷，會導致關節韌帶松弛、關節軟骨撞擊過度，從而使膝關節出現退變。因此，這種退變最易侵犯和最主要的發病部位是關節軟骨，在KOA 終末期可致關節功能障礙甚至殘疾[8]。

嚴重KOA 患者除了出現疼痛和功能障礙外，更多表現為屈曲攣縮并內翻畸形。由于膝關節在活動中膝內側間室承載的負荷最大，占人體重量的65%～70%[9]，膝關節內側間室高負荷的承載，使膝關節生物力線發生變化，出現不同程度的內側副韌帶及半膜肌腱攣縮；外側副韌帶松弛、內側半月板和脛骨內側平臺磨損、下沉等，從而使膝關節內側間室軟骨退變磨損、膝關節內翻加重[10]。

正常關節軟骨由4 層組成，依次為淺表層、過渡層、輻射層和鈣化層，前3 層合并稱為透明軟骨[11]。軟骨基質和軟骨細胞共同構成了關節軟骨，軟骨基質主要由水、膠原纖維和蛋白多糖構成，蛋白多糖存在于膠原纖維之間，屬于親水分子，可產生高度張力，提供關節軟骨的彈性和韌性，而水占關節軟骨重量的80%，可保持軟骨組織的正常形態。關節的軟骨下骨由軟骨下骨板和骨小梁組成。膝關節軟骨尤其是股骨髁軟骨的退行性變及生物學特異性可能是KOA 重要的影響因素，關節軟骨退行性變與關節軟骨下骨塑形改建在KOA 內翻畸形的發生發展中起著非常重要的作用。關節軟骨鈣化層的病變協同軟骨下骨的塑形改建進一步加快了關節軟骨退行性變的進程，更有可能是KOA 內翻畸形的始動因素[12]。

本研究通過大體觀察、光鏡及掃描電鏡等對KOA 內翻畸形股骨髁內側髁與外側髁的關節軟骨進行形態學觀察，大體觀察結果可以看到股骨內側髁關節面不光整，并有缺損，色澤灰暗、變黃，軟骨下骨外露，股骨髁邊緣骨贅多處可見，可能是隨著年齡的增長及關節反復活動出現關節磨損，大量關節軟骨基質降解，導致KOA 內翻畸形患者關節軟骨表面變薄、缺損及粗糙不平。且隨著OA 病變發展，關節軟骨深層出現裂隙并進一步加深[13]。此外，關節軟骨發生色澤上由正常的乳白色半透明狀轉變為暗黃、渾濁的形態學改變。HE 染色結果顯示，KOA 內翻畸形股骨髁內側髁軟骨表面殘缺不齊，軟骨細胞排列紊亂，呈團狀雜亂分布，軟骨陷窩及軟骨下骨可觀察到彌漫性局灶增生改變。提示軟骨細胞的代謝、更新是持續存在的，也說明存在軟骨細胞再生及軟骨基質中的水及蛋白含量異常改變。然而，此改變并不能阻止淺表層軟骨退變、缺損和凋亡等病理過程的發生發展[14-16]。通過番紅O-固綠染色，可以觀察到KOA 內翻畸形股骨髁內側髁關節軟骨基質含量明顯減少，嗜堿性番紅染色著色不一，嗜酸性固綠染色在關節軟骨層接近軟骨下骨的部分有著色，說明軟骨下骨的基質已發生纖維化改變，這也可能是軟骨下骨化的重要原因。推測在KOA 病變的前期，軟骨基質的變化可能早于軟骨細胞[17]，此病理過程由細胞因子、炎性介質、蛋白聚糖酶等多種信號轉導通路調控[18-19]。

本研究還觀察到，對照組患者的KOA 內翻畸形股骨髁內側髁軟骨組織及軟骨下骨中都檢測到了大量的Osterix 陽性表達，而觀察組的KOA 內翻畸形股骨髁外側髁軟骨組織有少量表達。Osterix 蛋白是一種在骨基質、骨膜和軟骨基質高表達的極不穩定轉錄因子，其穩定性可因多種因素改變，被視為衡量基質蛋白穩定性、成骨活性和轉錄潛能的標志[18]。通過掃描電鏡觀察，KOA 內翻畸形股骨髁內側髁關節軟骨缺損嚴重，結構紊亂，有代償性增生及軟骨缺失后出現的空洞裂隙。從超微結構上觀察到，KOA 發展到中、晚期出現嚴重的內翻畸形，負重關節的股骨內髁與脛骨內側平臺關節軟骨面互相磨損、缺失及塌陷等病理改變漸進性加重[6]。

綜上所述，本研究通過組織形態學觀察KOA內翻畸形兩側的股骨髁關節軟骨，通過其病理改變證實了關節軟骨鈣化層的病變協同軟骨下骨的塑形改建在KOA 內翻畸形病情的發生發展中起著重要作用，這為進一步探討KOA 在中、晚期病變中出現內翻畸形的機制研究提供了實驗依據。但本研究還存研究的臨床病例有限和缺少分子生物學相關的實驗數據、相關指標及具體的組織形態計量學參數等不足，有待今后的臨床基礎實驗中進一步完善。