子宮內膜容受性檢測聯用胚胎植入前遺傳學檢測在反復種植失敗患者中的效果研究

袁振亞，袁牧，朱云霞，宋雪梅，林繼慧

(徐州市婦幼保健院生殖醫學中心,徐州 221009)

反復種植失敗(repeated implantation failure,RIF)是人類輔助生殖技術(ART)從業者面臨的一大難題,在IVF-ET中的發生率約為10%[1]。多次移植失敗不僅會浪費珍貴的胚胎,還會增加患者的心理及經濟負擔。因此,探究RIF發生的影響因素、改善RIF患者IVF結局成為了當前的研究熱點。

子宮內膜對于胚胎的最佳容受時期稱為種植窗(window of implantation,WOI)。WOI發生偏移是RIF發生的重要因素之一[1-2]。通過子宮內膜容受性檢測(endometrial receptivity testing,ERT)技術對轉錄組標記物進行下一代測序(next-generation sequencing,NGS),可精確判斷RIF患者WOI具體時期,幫助及時調整移植策略,在WOI植入胚胎,可顯著改善RIF患者的移植結局[3-4]。2018年中國《胚胎植入前遺傳學診斷/篩查技術專家共識》指出,RIF是胚胎植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing,PGT)的重要指征之一[5],應用PGT可顯著改善RIF患者的移植結局[6-7]。然而,仍有部分RIF患者接受ERT評估或接受PGT后無法獲得成功妊娠。目前,國內尚未見ERT與PGT技術聯用的報道。為探究ERT與PGT技術聯合應用的效果,本研究對聯用ERT與PGT技術的RIF患者的凍融胚胎移植(FET)周期進行了回顧分析,為尋找新的RIF治療方法提供參考依據。

資料和方法

一、研究對象

本研究選取2018年1月至2023年1月在徐州市婦幼保健院生殖醫學中心接受FET的RIF患者。

納入標準:(1)患者符合本中心RIF的診斷標準(移植3次及以上均失敗或移植了高評分卵裂期胚胎數4～6個或高評分囊胚數3個及以上均失敗的患者)[5];(2)FET采用激素替代方案進行內膜準備;(3)每個FET周期移植1枚囊胚。

排除標準:(1)前次FET或自然受孕有異位妊娠史;(2)FET前子宮內膜厚度小于7 mm;(3)男方患有嚴重畸精子癥(正常形態精子比例小于1%);(4)男方精子DNA碎片率大于30%;(5)患者宮腔解剖學異常(如粘連、子宮畸形等);(6)患者患有多囊卵巢綜合征;(7)患者患有系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。

共納入了符合標準的RIF患者的730個FET周期,根據患者接受的評估檢測不同分成4組:僅接受PGT的FET周期為PGT組(n=121),僅接受ERT評估的FET周期為ERT組(n=147),接受ERT后移植PGT周期整倍體囊胚的FET周期為聯用組(n=138),同期未接受PGT與ERT的FET周期為RIF組(n=324)。

本研究通過了徐州市婦幼保健院生殖醫學倫理委員會的倫理審查批準(批件號:[2023]生殖倫審第(01)號)。

二、研究方法

1.ERT評估模型:中南大學湘雅醫院和江蘇億康基因科技有限公司合作開發了ERT技術(專利號:201910324707.0),構建了子宮內膜容受期及非容受期的轉錄組模型。采集受試者的子宮內膜樣本,提取mRNA進行高通量測序,獲得受試者的子宮內膜轉錄組數據代入模型進行分析,可精準地判斷受試者的WOI是否發生偏移,并推算出具體的WOI。

2.激素替代方案(HRT)及內膜準備:月經第2天,全部患者使用長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a,珠海麗珠)3.75 mg/次 1次/d,使用28 d后開始雌二醇(雅培,荷蘭)4～6 mg/d連用14 d。當內膜厚度達到7.5 mm及以上時,全部患者使用90 mg/d黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾,英國)、10 mg地屈孕酮(達芙通;雅培,荷蘭)每日口服2次,共轉化5 d。轉化第6天PGT組和RIF組停用黃體酮和地屈孕酮進行FET;ERT組和聯用組停用黃體酮和地屈孕酮,接受ERT評估,在有明確ERT評估結果后,ERT組和聯用組再次進行HRT,根據ERT結果調整使用黃體酮和地屈孕酮的轉化時長后再行FET。

3.ERT評估:在ERT組、聯用組患者黃體酮轉化第6天使用一次性子宮內膜樣本采樣器(蘇州序康醫療科技)伸入宮腔抽吸約3 mm大小的活檢樣本,推入RNA樣本保存液(蘇州序康醫療科技)4℃保存;使用RNeasy Micro Kit試劑盒(Qiagen,德國)進行mRNA提取,使用MALBAC白金微量 RNA 擴增試劑盒(蘇州億康基因科技)進行RNA擴增,使用NGS 通用 Index 試劑盒(Illumina,美國)和Miseq基因測序儀(Illumina,美國)進行mRNA測序;將測序結果代入子宮內膜容受期模型,推算患者WOI,調整FET時間。PGT組、RIF組不進行此步驟。

4.囊胚PGT:對PGT組和聯用組第5、6天的囊胚外滋養層細胞進行活檢,對活檢產物使用胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒(北京中儀康衛)進行全基因組擴增,使用 Illumina Miseq測序平臺(Illumina,美國)進行NGS。數據下機后完成測序質控,進行生物信息學分析,獲得受檢囊胚遺傳學檢測信息,篩選整倍體囊胚進行FET。ERT組、RIF組不進行此步驟。

5.囊胚移植:在黃體酮轉化第6天,對RIF組實施囊胚移植;根據ERT評估結果調整移植時間,在WOI內對ERT組實施囊胚移植;篩選整倍體囊胚,根據ERT評估結果調整移植時間,在WOI內對聯用組實施囊胚移植;篩選整倍體囊胚,對PGT組實施囊胚移植。

三、觀察指標

各組患者基礎資料,包括女方年齡、男方年齡、不孕年限、不育年限、體質量指數(BMI)、基礎激素水平;FET相關資料,包括移植日內膜厚度、胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%、HCG陽性率=HCG陽性FET周期數/FET周期數×100%、宮內妊娠率=宮內妊娠FET周期數/FET周期數×100%、異位妊娠率=異位妊娠FET周期數/FET周期數×100%、流產率=流產FET周期數/獲宮內妊娠FET周期數×100%、活產率=活產分娩周期數/FET周期數×100%;ERT組患者WOI偏移率=ERT組WOI偏移患者數/ERT組患者數×100%;聯用組患者WOI偏移率=聯用組WOI偏移患者數/聯用組患者數×100%;接受ERT評估的患者WOI偏移率(ERT組與聯用組WOI偏移患者數/ERT組與聯用組患者數×100%)。

四、統計學處理

結 果

一、患者一般資料

本研究共納入了符合標準的患者的730個FET周期,其中PGT組121周期(n=121),ERT組147周期(n=147),聯用組138周期(n=138),RIF組324周期(n=324)。

患者一般資料的分析結果顯示,各組間的女方年齡、男方年齡、不孕年限、不育年限、BMI、基礎激素水平[卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、泌乳素(PRL)及黃體生成素(LH)]均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料[(-±s),M(P25,P75)]

二、ERT組和聯用組的ERT評估結果

接受ERT評估的ERT組和聯用組共285個周期,其中273個周期出現了WOI后移,即在常規內膜準備情況下,按月經周期推算出的最佳移植時期實際為容受前期,實際的WOI較常規WOI推后1～2 d,接受ERT評估的患者WOI偏移率達到了95.79%(273/285)。ERT組WOI偏移率達到了96.60%(142/147);聯用組WOI偏移率達到了94.93%(131/138)。

三、各組FET周期臨床結局比較

PGT組、ERT組、聯用組和RIF組移植優質囊胚占比分別為89.26%(108/121)、85.71%(126/147)、87.68%(121/138)和83.95%(272/324),組間無顯著差異(P>0.05)。各組移植當日的內膜厚度、異位妊娠率、流產率也均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 患者FET周期結局[(-±s),%]

聯用組的胚胎種植率、宮內妊娠率、活產率均顯著高于其余3組(P<0.05);聯用組的HCG陽性率顯著高于PGT組與RIF組(P<0.05),雖高于ERT組,但差異尚無統計學意義(P>0.05);PGT組的胚胎種植率、HCG陽性率、宮內妊娠率均顯著高于RIF組(P<0.05);PGT組的活產率高于RIF組,但差異尚無統計學意義(P>0.05);ERT組的HCG陽性率、宮內妊娠率均顯著高于RIF組(P<0.05);ERT組的胚胎種植率、活產率均高于RIF組,但差異尚無統計學意義(P>0.05);ERT組與PGT組的胚胎種植率、HCG陽性率、宮內妊娠率、活產率均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

四、RIF患者活產的影響因素

Spearman相關分析顯示,RIF患者FET后獲得活產與實施PGT、接受ERT、接受優質囊胚移植顯著正相關(P<0.05);與女方年齡、男方年齡顯著負相關(P<0.05);與不孕類型(原發不孕/繼發不孕)、不育類型(原發不育/繼發不育)、不孕年限、不育年限、BMI、FSH、E2、P、PRL、LH、移植當日內膜厚度、冷凍日囊胚發育天數(D5/D6)、受精方式(ICSI/IVF)、囊胚D3卵裂球數的相關性不顯著(P>0.05)。以“獲得活產”作為因變量,“實施PGT”、“接受ERT”、“接受優質囊胚移植”、“女方年齡”、“男方年齡”5個變量為協變量,進行Logistic回歸分析,結果表明:實施PGT、接受ERT、接受優質囊胚移植、女方年齡4個變量是獲得活產的獨立影響因素(P<0.05)(表3)。其中“實施PGT”的校正后OR=1.975,說明接受PGT后移植整倍體囊胚獲得活產的概率是不接受PGT的1.975倍;“接受ERT”的校正后OR=1.711,說明接受ERT評估后在WOI移植獲得活產的概率是不接受ERT的1.711倍;“接受優質囊胚移植”的校正后OR=1.677,說明選擇優質囊胚進行FET獲得活產的概率是選擇非優質囊胚的1.677倍;“女方年齡”的校正后OR=0.941<1,說明女方年齡越大,獲得活產的概率越低(表3)。

表3 影響活產的多因素Logistic回歸分析

討 論

從目前的研究結果來看,導致RIF的原因主要有胚胎因素與子宮內膜容受性因素。PGT技術提供了有力的胚胎學支持,讓RIF的診斷不僅依靠臨床假設[8]。ERT技術的出現則首次從分子生物學角度闡述了RIF發生的可能機制,并開辟了臨床治療RIF的新途徑[1,3]。應用PGT技術幫助篩選整倍體胚胎,或經ERT評估后在WOI內完成胚胎移植,均可改善RIF患者的FET結局[3,6]。然而,仍有一部分RIF患者通過PGT移植整倍體胚胎或在WOI內接受胚胎移植未獲成功妊娠和活產,這說明對于同一個RIF患者,胚胎染色體異常和子宮內膜容受性不佳兩種因素可能同時存在,且可能還有更多未被闡明的影響RIF成功率的因素。為探究這些患者生育問題的解決方法,我們分析比較了聯用ERT與PGT、單獨接受ERT和單獨應用PGT的RIF患者的FET結局。研究結果證明,聯用ERT與PGT是治療RIF的一次成功嘗試。經過ERT評估后,在WOI內移植整倍體囊胚,可進一步顯著改善RIF患者的FET結局。

探究RIF治療方法的最終目的是使RIF患者獲得活產。女方年齡、接受ERT、實施PGT、囊胚質量是影響RIF患者活產率的4個重要因素。在未進行PGT的情況下,篩選優質胚胎用于移植是提高RIF患者成功率的關鍵之一。相比形態學表現欠佳的胚胎,優質胚胎具有更高的整倍體率、更好的發育潛能[9]。在母胎界面,囊胚需要先脫出透明帶才能完成在子宮內膜種植的過程。FET的過程需要讓胚胎經歷冷凍和凍融的操作,可能會導致透明帶硬化影響囊胚孵出,導致種植失敗。優質囊胚具有很強的抗逆能力,可在凍融后快速復蘇擴張,降低透明帶硬化對胚胎種植的影響[10]。

本研究發現,在僅接受PGT和PGT、ERT均未接受的兩類RIF患者中,未獲活產患者的女方年齡均顯著高于獲得活產患者(P<0.05),且獲得活產患者移植優質囊胚占比均顯著高于未獲活產(P<0.05),提示女方患者年齡、囊胚質量可能是影響活產的重要因素,且即便是整倍體囊胚,優質的囊胚可能具有更佳的發育潛能;然而,在僅接受ERT和同時接受PGT與ERT的兩類RIF患者中,獲得活產者與未獲活產者的女方年齡、移植優質囊胚占比均沒有顯著差異(P>0.05),提示可能還有其它原因影響RIF患者的活產率。

本研究中接受ERT評估的RIF患者WOI偏移率達到了95.79%,與本中心前期研究持平,顯著高于其他研究的WOI偏移率(P<0.05),這可能與嚴格根據指征篩選受試者有關[1,3]。外源激素可影響子宮內膜多個基因的表達,因此,人工激素內膜準備的用藥方案不同,也可能導致ERT評估WOI偏移率出現差異[1]。

本研究共納入RIF患者730個FET周期,分為了4個研究組,每組的樣本量、患者選擇具有一定局限性。雖然在IVF中RIF的發生率約為10%,但其中一部分患者伴有子宮內膜厚度不夠、宮腔解剖學異常、男方精子異常等會明顯影響種植率或胚胎質量的因素,這些患者的FET周期在本研究中需要被剔除;本研究各組患者女性平均年齡<34歲,IVF結局較好,但高齡、胚胎質量差、無法在IVF中獲得囊胚的RIF患者的FET周期則無法被納入本研究,而以上患者雖然在RIF患者群體中占比不高,卻是ART治療的一大難點。因此,需要更多、更深入的研究來開發這部分患者的RIF治療方法。

除胚胎整倍性與子宮內膜WOI以外,胚胎種植成功率也受多種因素的影響。子宮內膜母胎界面的免疫異常被認為會干擾胚胎種植,可能為導致RIF的原因之一[8,11-13];子宮內膜的血流灌注狀態也與內膜容受性相關,從而影響胚胎種植[14];細胞調控因子(包括microRNA、lncRNA、circular RNA等)廣泛參與了子宮內膜容受性相關的基因表達、信號轉導與相互作用的調控,對胚胎的成功種植具有重要意義[15-16]。針對以上因素,研究人員嘗試了一系列臨床應對措施,包括應用低分子肝素改善母體高凝狀態;對免疫過度活躍患者應用免疫抑制劑,如外源糖皮質激素糾正輔助性T細胞1/輔助性T細胞2的異常、環孢素A抑制效應T細胞激活等;對免疫不活躍患者進行內膜機械刺激改善血流狀態;宮腔灌注改善胚胎粘附環境等,改善了RIF患者的移植結局[8]。此外,多種細胞調控因子被認為是反映子宮內膜容受性的分子標志物,在未來具有被應用于臨床判斷子宮內膜容受狀態的重要價值[17]。

在國外,PGT技術被認為可以有效改善RIF患者移植結局,而子宮內膜容受性分析(endometrial receptivity analysis,ERA)技術、聯用ERA和PGT技術對RIF患者的臨床應用效果存在爭議[18-20]。目前來看,ERT技術在國內RIF患者中的應用效果良好,PGT技術能夠改善RIF患者FET結局的觀念也被廣泛認可[3,5-7]。本研究結果證明,聯用ERT與PGT技術,可在PGT或ERT應用的基礎上,進一步顯著提升RIF患者FET的胚胎種植率、宮內妊娠率與活產率,為尋找新的RIF治療方法提供了依據,但此聯用技術在高齡、胚胎質量差或IVF僅有卵裂期胚胎的RIF患者中應用效果仍需更多分析和研究。