基于小鼠譜系追蹤的圍著床期子宮內膜上皮-間質轉化探究

唐心怡，曹志文，王曉瑩，周繼東，張陽，岳秋玲，姜瑞偉，李朝軍，顏桂軍，孫海翔*

(1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心,南京 210008;2.南京醫科大學生殖醫學與子代健康全國重點實驗室,南京 211116)

子宮內膜是女性生殖系統的重要組織器官,具有周期性重塑、蛻膜化和胚胎種植等生理功能,而這些關鍵生理功能需要該組織的細胞在間質和上皮表型之間轉換[1-2],這一過程被稱為上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)或間質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition,MET)。其中,MET主要參與子宮內膜的周期性重塑與蛻膜化過程,而EMT主要參與胚胎著床過程[1,3]。在胚胎種植過程中發生的EMT,使子宮內膜腔上皮細胞獲得細胞間黏附減少、遷移能力增加的間充質特征,有利于胚胎滋養層細胞的侵襲[4]。然而,由于倫理和技術等方面的限制,目前關于子宮內膜的EMT研究主要為體外實驗[5],尚無動物實驗證據證明子宮內膜在胚胎種植過程能夠發生EMT。因此,用動物模型證明該過程中EMT的發生,尤其是找到上皮細胞EMT后成為間質細胞的直接形態學證據,對于這一領域的研究具有重大意義。

譜系追蹤技術是一種用于追蹤和分析細胞增殖分化過程中細胞譜系的方法。通過引入遺傳標記物(如熒光基因)對特定細胞群進行標記,隨著細胞的增殖與分化,這些標記物會被傳遞給后代細胞,因此可根據遺傳標記物的存在判斷細胞的譜系來源。本研究擬構建LtfcreRosa26mT/mG小鼠用于研究胚胎種植過程中的子宮內膜上皮細胞的EMT行為,利用譜系追蹤技術尋找子宮內膜中上皮細胞EMT后轉化為間質細胞的直接形態學證據,并進一步探究圍著床期與激素刺激下子宮內膜EMT的變化情況。

材料與方法

一、實驗動物

本研究中使用的Rosa26mT/mG(Rosa26KI/KI)小鼠由廈門大學王海濱教授團隊贈與,Ltf-Cre(LtfCre/WT)小鼠由華南農業大學蘇仁偉教授團隊贈與。實驗(不包括繁育過程)共使用可育雄鼠12只,LtfcreRosa26mT/mG雌鼠36只,其中21 d雌鼠3只,6周齡雌鼠3只,8周齡雌鼠30只。所有小鼠均飼養于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物房,飼養環境溫度為19～22℃,相對濕度40%～70%,采用12 h明/暗光照循環(7:00—19:00),自由飲水和進食,適應性喂養一周后進行下一步實驗。所有動物實驗均在江蘇省實驗動物管理委員會指導下進行,并經南京鼓樓醫院實驗動物倫理委員會(SYXK 2021-0509)批準。

二、實驗試劑

雌二醇(E2,E2758)、孕酮(P4,P0130)、芝麻油(S3547)均購自美國Sigma-Aldrich公司;兔抗E-Cadherin單抗(3195S)購自美國CST公司;兔抗Vimentin多抗(BS1855)購自美國Bioworld公司;兔抗CD45多抗(ab10558)和驢抗兔Alexa Fluor647熒光二抗(ab150075)均購自英國Abcam公司;PCR試劑盒(P213-01)購自南京諾維贊公司,PCR引物由南京金斯瑞公司合成。

三、實驗方法

1.LtfcreRosa26mT/mG小鼠的配繁與鑒定:將P0代Rosa26mT/mG(Rosa26KI/KI)小鼠和P0代Ltf-Cre(LtfCre/WT)小鼠雜交,P1代中50%為LtfCre/WTRosa26KI/WT小鼠,50%為LtfWT/WTRosa26KI/WT小鼠。通過P1代LtfCre/WTRosa26KI/WT小鼠與P0代Rosa26KI/KI小鼠再次雜交,P2代中25%為LtfCre/WTRosa26KI/KI小鼠,即LtfCreRosa26mT/mG小鼠。繁育過程中,通過鼠尾PCR方法鑒定小鼠基因型。PCR反應條件為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個循環;72℃進一步延伸10 min。引物及序列見表1。

表1 引物及序列

2.胚胎種植時間點小鼠收樣:6:00 pm將12只8周齡的LtfcreRosa26mT/mG雌鼠與12只可育雄鼠按1∶1合籠,次日8:00 am檢查雌鼠陰道及陰道口周圍,若見到白色陰栓,則判定雌雄鼠交配,當天上午記為0.5 dpc(0.5 day post copulation),在2.5 dpc、3.5 dpc、4.0 dpc或4.5 dpc時處死小鼠,取出小鼠子宮,液氮速凍后保存于-80℃。每個時間點取3只小鼠進行實驗。

3.雌孕激素序貫刺激造模:15只8周齡的雌性LtfcreRosa26mT/mG小鼠分為5組(每組3只),進行卵巢切除手術。術后休息2周后,處死第1組小鼠,記為“卵巢切除術后2周”組;剩余4組小鼠連續3 d皮下注射50 μl含有100 ng E2的芝麻油,第三次注射E2后6 h后處死第2組小鼠,記為“E2后6 h”組,2 d后處死第3組小鼠,記為“E2后休息2 d”組;剩余2組小鼠連續2 d皮下注射50 μl含有1 mg P4、10 ng E2的芝麻油,第二次注射P4+ E2后6 h處死第4組小鼠,記為“P4后6 h”組,剩余1組小鼠休息5 d后處死,記為“P4后休息5 d”組。小鼠處死后快速收取子宮組織,液氮速凍后保存于-80℃。具體造模與收樣方法見圖4A。

4.組織冰凍切片與染色:待測組織離體后去除表面多余水分,經液氮冷凍后,進行冰凍切片(厚度為10 μm);37℃烤片3 min,隨后使用4% PFA/PBS室溫避光固定15 min;PBS洗3遍,每次5 min;山羊血清室溫封閉1 h后,一抗(1∶500稀釋)4℃避光孵育過夜,PBS洗3遍,每次5 min;二抗(1∶500稀釋)室溫避光孵育1 h,PBS洗3遍,每次5 min;DAPI室溫避光染色10 min,PBS洗3遍,每次5 min;抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡拍照。

四、統計學分析

結 果

一、LtfcreRosa26mT/mG小鼠模型驗證

為了驗證LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內膜上皮細胞的重組效率,以及確定開始重組、完成重組的時間,我們收集了出生后21 d、6周齡、8周齡的雌性LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮組織進行冰凍切片,熒光顯微鏡下鏡檢。結果顯示,出生后21 d的小鼠子宮內膜未見EGFP綠色熒光,證明該模型鼠不存在胚胎期Cre酶表達(圖1B),用于譜系追蹤研究時不會受到胚胎發育過程信號的干擾。在6周時,僅部分上皮細胞表現出EGFP熒光,而在8周小鼠完全性成熟后,所有上皮細胞均表現出EGFP熒光。此外,間質中也存在零星分布帶EGFP熒光的細胞(圖1C)。

A:LtfcreRosa26mT/mG小鼠模型構建圖;B:出生21 d后LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(5×);C:6周齡與8周齡LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(10×、20×)。

二、性成熟后LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內膜中存在由上皮細胞EMT形成的間質細胞

收集8周齡的雌性LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮組織進行冰凍切片,分別與上皮細胞、間質細胞、免疫細胞的標志物E-cadherin、Vimentin、CD45共染后,confocal鏡下觀察,間質中零星分布的EGFP+細胞中無E-cadherin+細胞,部分為CD45+的免疫細胞,部分為Vimentin+的間質細胞,這部分Vimentin+EGFP+細胞即為由上皮細胞EMT形成的間質細胞(圖2)。

子宮切片分別與E-cadherin、Vimentin、CD45共染,confocal成像(20×)。

三、胚胎圍著床期LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內膜間質EGFP熒光變化情況

為了探究胚胎種植過程中子宮內膜上皮細胞EMT的變化情況,以見栓當日上午為0.5 dpc,我們收集了2.5 dpc、3.5 dpc、4.0 dpc、4.5 dpc的LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮進行冰凍切片(圖3A),并計數間質中EGFP+細胞個數,發現在3.5 dpc間質中EGFP+細胞個數顯著降低(P<0.01)(圖3B)。

A:圍著床期不同時間點LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(20×);B:20×視野下胚胎圍著床期EGFP+間質細胞計數。注:與2.5 dpc比較,**P<0.01;與3.5 dpc比較,##P<0.01。

四、LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內膜間質EGFP+細胞受激素調控明顯

為了探究激素水平與子宮內膜上皮EMT的相關性,我們利用LtfcreRosa26mT/mG小鼠建立了雌孕激素序貫刺激模型(圖4A)。分別收集不同時間點的LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內膜進行冰凍切片(圖4B),計數間質中EGFP+細胞數量,結果發現E2刺激后間質中EGFP+細胞數量顯著降低(P<0.05),E2刺激休息2 d后間質中EGFP+細胞數量顯著增加(P<0.05),P4刺激后間質中EGFP+細胞數量又顯著降低(P<0.05)(圖4C)。

A:雌孕激素序貫刺激模型構建圖;B:雌孕激素序貫刺激不同時間點 LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(20×);B:20×視野下胚胎圍著床期EGFP+間質細胞計數。注:與卵巢切除術后2周比較,*P<0.05;與E2后6 h組比較,#P<0.05;與E2后休息2 d組比較,ΔP<0.05。

討 論

在本研究中,我們構建了LtfcreRosa26mT/mG上皮特異性譜系追蹤小鼠模型,首次在子宮內膜中找到了上皮細胞EMT形成的間質細胞,獲得了子宮內膜EMT的直接形態學證據。并且我們發現,8周齡性成熟的LtfcreRosa26mT/mG小鼠在未交配、無胚胎存在時,子宮內膜中已經存在由上皮細胞EMT形成的間質細胞,說明EMT可能不僅僅發生在胚胎種植過程中。在圍胚胎著床期,我們發現3.5 dpc的LtfcreRosa26mT/mG小鼠間質中EGFP+細胞個數顯著降低,而此時胚胎進入子宮但尚未開始種植,并且母體處于雌激素水平的高峰,因此我們認為激素水平對EMT可能存在影響,進一步研究雌孕激素對EMT的作用。在雌孕激素序貫模型中,我們發現LtfcreRosa26mT/mG小鼠在E2刺激后間質中EGFP+

細胞數量顯著降低,E2刺激休息2 d后間質中EGFP+細胞數量顯著增加,P4刺激后間質中EGFP+細胞數量又顯著降低,提示雌孕激素均能快速抑制子宮內膜EMT,而雌激素的撤退能夠促進子宮內膜EMT。

EMT是一系列引起細胞從上皮表型向間質表型轉化的生物過程的總稱[6]。上皮細胞通常具有頂-底極性,呈多角形,底面連接基膜,細胞間連接豐富,運動遷徙能力很弱;而間質細胞一般為長梭形,具有多極性,細胞間連接較少,可以通過細胞膜形成的偽足在細胞外基質間移動,具有較強的遷移和侵襲能力,并且能夠產生大量的細胞外基質[1]。根據EMT發生的場景和行使的功能,可將其分為三類[6]。I型EMT在胚胎種植、胚胎和器官發育過程中出現,過程既不產生纖維化,也沒有經脈管系統的轉移行為;Ⅱ型EMT在傷口愈合、組織再生、器官纖維化過程中出現,常常是損傷性修復的結果,往往伴隨著炎性反應;Ⅲ型EMT發生于腫瘤細胞,導致腫瘤的侵襲和遠處轉移[6]。本研究聚焦I型EMT過程,即胚胎種植過程中的EMT現象。

胚胎種植是指胚胎嵌入母體子宮壁的過程,是哺乳動物妊娠的關鍵步驟之一[7]。在胚胎發育過程中,囊胚滋養層細胞表現出上皮的特性,包括表達E-Cadherin等上皮特征性分子、具有頂-底極性、附著于基底膜、側壁與周圍細胞較為穩定的細胞連接等[1]。而在進入子宮,與子宮內膜相互作用以完成胚胎種植的過程中,滋養層細胞逐漸失去上皮表型,細胞連接消失、頂-底極性減弱、細胞骨架重塑、遷移能力增強[8],轉化為移動性、侵襲性更強的間充質表型,即發生了EMT[9]。子宮內膜上皮層作為與胚胎最先發生接觸的母體部位,相應地也發生EMT過程,以適應和促進胚胎的侵入過程。EMT過程受損,將會引起胚胎種植失敗[4]。EMT的時間和程度受到嚴格調控,過度的EMT會引起癌癥,而EMT不足將引起胎兒生長受限、子癇前期等妊娠期并發癥[10]。

目前大量體外實驗提示了胚胎種植過程中EMT的存在,但尚缺少動物實驗的結果,因此為了獲得子宮內膜EMT的直接形態學證據,我們以Rosa26mT/mG小鼠為基礎,通過Cre-LoxP重組酶系統建立模型小鼠,進行譜系追蹤研究。Rosa26是一個位于小鼠6號染色體的非編碼基因,在大部分組織和細胞中都有表達,是常用的插入外源基因表達的安全位點。Rosa26mT/mG小鼠的Rosa26基因中,插入的tdTomato(mT) 盒兩側具有 loxP 位點,其后具有終止密碼子,無Cre重組酶存在時使細胞表達tdTomato紅色熒光,在表達Cre重組酶的組織中敲除了mT盒及其后的終止密碼子,允許位于下游的EGFP(mG) 盒表達,使細胞呈現EGFP綠色熒光,而不表達Cre重組酶的組織仍然呈現出tdTomato紅色熒光。目前已有的標記上皮的Cre體系包括Wnt7a-Cre、Sprr2f-Cre和Ltf-Cre[11]。其中,Sprr2f-Cre在小鼠子宮上皮中引起的loxP重組并不均勻,僅有部分上皮細胞完成重組[12]。而Wnt7a在子宮發育過程具有重要功能,Wnt7a-Cre的重組發生在子宮完全成熟之前,不適合用于成年后生育相關的譜系追蹤研究[13]。Ltf-Cre雖然存在著免疫細胞表達的問題[14],但在子宮內膜上皮細胞中重組較為均勻、穩定,且在出生后性成熟時期才開始表達,是研究子宮內膜EMT的最適重組系統[11]。因此,我們選擇構建LtfcreRosa26mT/mG小鼠用于研究胚胎種植、激素作用過程中的子宮內膜上皮細胞的EMT行為。通過將LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片與E-cadherin、Vimentin、CD45共染結合激光掃描共聚焦熒光顯微鏡,我們成功找到了上皮細胞EMT形成的間質細胞,獲得了子宮內膜EMT的直接形態學證據,對女性生殖系統的EMT研究具有重大意義。

研究表明,小鼠著床部位存在EMT相關蛋白的改變,包括N-cadherin上調、E-cadherin和細胞角蛋白下調,而假孕小鼠中未觀察到這一現象,提示EMT可能僅發生在胚胎植入時[4]。然而,本研究表明,8周齡性成熟的LtfcreRosa26mT/mG小鼠在未交配、無胚胎存在時,子宮內膜已經存在由上皮細胞EMT形成的間質細胞,說明EMT可能不僅僅發生在胚胎植入時期,提示EMT可能參與子宮內膜的其他功能,需要進一步深入研究。

雌激素和孕激素是胚胎種植成功的必要因素[15]。雌孕激素可通過下調E-cadherin、上調N-cadherin和Vimentin進而誘導人子宮內膜腺癌細胞系Ishikawa細胞發生EMT,并增加人絨毛膜癌細胞系JAR球體的黏附與Ishikawa細胞的遷移能力[16]。雌激素受體β的拮抗劑PHTPP可以逆轉雌二醇在EMT中的作用[17]。濃度在0.1至10 μmol/L之間的雌激素可以調節EMT相關因子和肌動蛋白的重組,并增加子宮內膜上皮細胞的遷移和侵襲性[18]。雌二醇還通過上調MALAT1和下調miR200s表達在子宮內膜上皮細胞中誘導EMT,而MALAT1缺失或miR200c過度表達可顯著抑制雌二醇介導的EMT[17]。另一方面,孕酮在EMT誘導中的作用尚未得到證實[19-20]。在本研究中,我們利用LtfcreRosa26mT/mG小鼠建立了雌孕激素序貫刺激模型,發現E2刺激后間質中EGFP+細胞數量顯著降低,E2刺激后休息2 d后間質中EGFP+細胞數量顯著增加,P4刺激后間質中EGFP+細胞數量又顯著降低,提示在體內實驗中,雌孕激素均能快速抑制子宮內膜EMT,雌激素的撤退能夠促進子宮內膜EMT,這與體外實驗的結果矛盾,其原因可能在于動物體內細胞類型的復雜性和激素響應的延遲性,需要進一步深入研究。

鑒于EMT在成功植入中的重要性,通過藥物或其他治療手段調節EMT過程為提高輔助生殖技術的臨床妊娠率提供了新的思路。一些研究表明,表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)可能是介導雌激素誘導EMT的中間調控分子[21],在人類早期妊娠細胞滋養層培養物中添加EGF可使這些細胞的侵襲性增加數倍。這種生長因子增強人類細胞滋養層細胞侵襲的可能機制之一是增加細胞的運動性,這是與EMT過程相關的一個特定特征[22]。此外,據報道,單側宮內輸注EGF加靜脈注射EGF可增加大鼠子宮的胚胎著床數量[23]。然而,迄今為止的大部分臨床研究都集中在子宮內膜容受性的標志物上,對于EMT支持和增加胚胎著床的意義關注較少。因此,開發針對EMT相關信號分子的治療策略可能是提高臨床胚胎植入率的重要研究方向。

綜上所述,通過構建LtfcreRosa26mT/mG小鼠進行譜系追蹤研究,我們首次在子宮內膜中找到了上皮細胞EMT形成的間質細胞,獲得了子宮內膜EMT的直接形態學證據。另外,我們探究了圍胚胎著床期和雌孕激素序貫刺激對LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內膜中EMT的影響,發現EMT可能不僅僅發生在胚胎植入時期,EMT可能參與子宮內膜的其他功能并受到雌孕激素的嚴格調控,需要后續進一步深入研究。